Клонирование и анализ генов легких цепей иммуноглобулинов стерляди

Клонирование и анализ генов легких цепей иммуноглобулинов стерляди

            ÂÛÄÅËÅÍÈÅ ÂÛÑÎÊÎÌÎËÅÊÓËßÐÍÎÉ ÄÍÊ ÈÇ ÝÓÊÀÐÈÎÒÈ×ÅÑÊÈÕ ÊËÅÒÎÊ

          1 ã ïå÷åíè ñòåðëÿäè, çàìîðîæåííîé â æèäêîì àçîòå, ðàñòèðàëè â òîíêèé ïîðîøîê è ãîìîãåíèçèðîâàëè â 15 ìë ðàñòâîðà, ñîäåðæàùåãî 0,5 Ì Na2ÝÄÒÀ, ðÍ 8,0, 0,5% ñàðêîçèëà, 100 ìêã/ìë ïðîòåèíàçû Ê è íàãðåòîãî äî 65îÑ. Çàòåì èíêóáèðîâàëè ïðè 50îÑ òå÷åíèå 3 ÷àñîâ ïðè ëåãêîì ïîêà÷èâàíèè. Çàòåì, èçáåãàÿ ðåçêèõ âñòðÿõèâàíèé, ýêñòðàãèðîâàëè ÄÍÊ ðàâíûì îáúåìîì ôåíîëà òðè ðàçà, êàæäûé ðàç ðàçäåëÿÿ ôðàêöèè öåíòðèôóãèðîâàíèåì ïðè 4000 g è êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå. Ôåíîë ïðåäâàðèòåëüíî î÷èùàëè ïåðåãîíêîé è íàñûùàëè áóôåðîì, ñîäåðæàùèì 1 Ì òðèñ-HCl, îäèí ðàç è äâà ðàçà áóôåðîì, ñîäåðæàùèì 0,1 Ì òðèñ-HCl è 0,1% 2-ìåðêàïòîýòàíîë. Äèàëèç ÄÍÊ ïðîâîäèëè ïðè 10îÑ â òå÷åíèå 12 ÷àñîâ ïðîòèâ 4 ë áóôåðà, èìåþùåãî ñîñòàâ:

  50 ìÌ òðèñ-HCl, ðÍ 8,0,

  10 ìÌ Na2ÝÄÒÀ,

  10 ìÌ NaCl.

          Çàòåì îáðàáàòûâàëè ïðîáó ÐÍÊàçîé, ñâîáîäíîé îò ÄÍÊàçû,ïðè 37îÑ â òå÷åíèå 1 ÷àñà â êîíöåíòðàöèè 100 ìêã/ìë. Ïîñëå ýòîãî ýêñòðàãèðîâàëè ÄÍÊ ðàâíûì îáúåìîì ñìåñè ôåíîë-õëîðîôîðì (1:1) äâà ðàçà è ïðîâîäèëè äèàëèç ïðè 10îÑ â òå÷åíèå 36 ÷àñîâ ïðîòèâ 10 ë áóôåðà TE (10 ìÌ òðèñ-HCl, 1 ìÌ Na2ÝÄÒÀ, ðÍ 7,5), ìåíÿÿ áóôåð ÷åðåç êàæäûå 12 ÷àñîâ (Ìàíèàòèñ è äð., 1984).

            ÊÎÍÑÒÐÓÈÐÎÂÀÍÈÅ ÁÈÁËÈÎÒÅÊÈ êÄÍÊ

          Âûäåëåíèå ïîëè(A)+ÐÍÊ.

          Äëÿ èíãèáèðîâàíèÿ ÐÍÊàçû âñå ðàñòâîðû, íå ñîäåðæàùèå òðèñ, îáðàáàòûâàëè 0,1% äèýòèëïèðîêàðáîíàòîì 12 ÷àñîâ ïðè 37îÑ è àâòîêëàâèðîâàëè. Ïîñóäó ïðîêàëèâàëè ïðè 250îÑ â òå÷åíèå 4 ÷àñîâ. Ïîëè(A)+ÐÍÊ âûäåëÿëè èç ñóììàðíîé ÐÍÊ ëåéêîöèòîâ ñòåðëÿäè ìåòîäîì õðîìàòîãðàôèè íà îëèãî(dT)-öåëëþëîçå. Äëÿ ýòîãî ÐÍÊ ðàñòâîðÿëè â âîäå, ïðîãðåâàëè ïðè 65îÑ â òå÷åíèå 5 ìèí, äîáàâëÿëè ðàâíûé îáúåì 2-êðàòíîãî áóôåðà äëÿ íàíåñåíèÿ ÐÍÊ (40 ìÌ òðèñ-HCl, ðÍ 7,6, 1 Ì NaCl, 2 ìÌ Na2ÝÄÒÀ, 0,2% SDS) è òðèæäû ïðîïóñêàëè ÷åðåç êîëîíêó ñ îëèãî(dT)-öåëëþëîçîé. Çàòåì ïðîìûâàëè êîëîíêó 5-10 îáúåìàìè áóôåðà äëÿ íàíåñåíèÿ è 4 îáúåìàìè ýòîãî æå áóôåðà, ñîäåðæàùåãî 0,1 Ì NaCl. Ïîñëå ýòîãî ýëþèðîâàëè ïîëè(A)+ÐÍÊ â 2-3 îáúåìàõ âîäû, îáðàáîòàííîé äèýòèëïèðîêàðáîíàòîì, äîáàâëÿëè 2,2 îáúåìà ýòàíîëà è îñàæäàëè öåíòðèôóãèðîâàíèåì â òå÷åíèå 10 ìèí ïðè 12000 g ïðè 4îÑ (Ìàíèàòèñ è äð., 1984).

          Ñèíòåç êÄÍÊ.

          Ñèíòåç êÄÍÊ ïðîâîäèëè â ñîîòâåòñòâèè ñ ïðîòîêîëîì ôèðìû Stratagene. Ïî ìàòðèöå ïîëè(A)+ÐÍÊ ñèíòåçèðîâàëè ïåðâóþ öåïü êÄÍÊ (ðèñ. 9).

          Ðåàêöèîííàÿ èìåëà ñîñòàâ:

  5 ìêë 10-êðàòíîãî áóôåðà äëÿ ñèíòåçà ïåðâîé öåïè,

  3 ìêë ñìåñè ìåòèë-dÍTÔ,

  2 ìêë ðàñòâîðà ïðàéìåð-ëèíêåðà (1.4 ìêã/ìêë),

  1 ìêë èíãèáèòîðà ÐÍÊàçíîé àêòèâíîñòè,

  1.5 ìêë ôåðìåíòà îáðàòíàÿ òðàíñêðèïòàçà (50 å.à./ìêë),

  âîäà äî ñóììàðíîãî îáúåìà 50 ìêë.

          Ñìåñü èíêóáèðîâàëè ïðè 37îÑ â òå÷åíèå 1 ÷àñà. Çàòåì îõëàæäàëè äî 0îÑ è äîáëÿëè êîìïîíåíòû äëÿ ñèíòåçà âòîðîé öåïè êÄÍÊ:

  20 ìêë áóôåðà äëÿ ñèíòåçà âòîðîé öåïè,

  6 ìêë ñìåñè dÍTÔ,

  88,9 ìêë ñòåðèëüíîé âîäû,

  2 ìêë 32Ð-dÍTÔ (800 Êè/ìÌ),

  2 ìêë ðàñòâîðà ÐÍÊàçûH (1.5 å.à./ìêë),

  11.1 ìêë ÄÍÊ ïîëèìåðàçû I.

          Ñìåñü èíêóáèðîâàëè ïðè 16îÑ â òå÷åíèå 2,5 ÷àñîâ, çàòåì îõëàæäàëè äî 0îÑ è äîáàâëÿëè êîìïîíåíòû äëÿ çàñòðîéêè “ëèïêèõ” êîíöîâ:

  23 ìêë ñìåñè äÍTÔ,

  2 ìêë Pfu ÄÍÊ ïîëèìåðàçû (2,5 å.à./ìêë).

          Ñìåñü èíêóáèðîâàëè ïðè 72îÑ â òå÷åíèå 30 ìèí.

Çàòåì ïðîâîäèëè ýêñòðàêöèþ ðàâíûì îáúåìîì ñìåñè ôåíîë-õëîðîôîðì (1:1) è ðàâíûì îáúåìîì õëîðîôîðìà, ïîñëå ÷åãî îòáèðàëè âîäíóþ ôàçó, äîáàâëÿëè 20 ìêë 3Ì NaAc è 400 ìêë 96% ýòàíîëà è îñàæäàëè êÄÍÊ öåíòðèôóãèðîâàíèåì ïðè 12000 g â òå÷åíèå 12 ìèí.

          Ñøèâêà ìîëåêóë êÄÍÊ ñ âåêòîðîì.

          êÄÍÊ ðàñòâîðÿëè ñ EcoR I àäàïòîðàìè (ðèñ. 9) è èíêóáèðîâàëè ïðè 4îÑ â òå÷åíèå 30 ìèí. Çàòåì äîáàâëÿëè êîìïîíåíòû äëÿ ñøèâêè ìîëåêóë àäàïòîðîâ è ìîëåóë êÄÍÊ:

                        ïðàéìåð-ëèíêåð

          5' CTCGAGTTTTTTTTTTTT  3'

                3' AAAAAAAAAAAA                   5'

ñèíòåç êÄÍÊ, ñøèâêà ñ EcoR I àäàïòîðàìè, îáðàáîòêà ðåñòðèêòàçîé Xho I, ôîñôîðèëèðîâàíèå êîíöåâûõ íóêëåîòèäîâ

                              ïîëè(A)+ÐÍÊ

           Xho I ñàéò                1-ÿ öåïü          EcoR I àäàïòîð

5' ð-TCGAGTTTTTTTTTTTT,,,,,,,,CTCGTGCCG-ð     3'

         3'     ð-CAAAAAAAAAAAA        GAGCACGGCTTAA-ð 5'

                             2-ÿ öåïü 

			ôðàãìåíò êÄÍÊ
							ñøèâêà ñ âåêòîðîì, ðàñùåïëåííûì ïî ñàéòàì ðåñòðèêöèè Xho I è EcoR I

 

                             Xho I ñàéò              êÄÍÊ              EcoR I ñàéò

         5'      CTCGAGTTTTTTT,,,,,,,,,CTCGTGCCGAATTC      3’

         3'      GAGCTCAAAAAAA         GAGCACGGCTTAAG      5’

                     ÄÍÊ âåêòîðà                                                      ÄÍÊ âåêòîðà

          Ðèñ. 9. Ñõåìà ñèíòåçà êÄÍÊ ïî ìàòðèöå ïîëè(A)+ÐÍÊ è ñøèâêè ñ ïëàçìèäíûì âåêòîðîì

pBluescript KS(+) ïî ñàéòàì EcoR I è Xho I.

          Îáîçíà÷åíèÿ:,,,,, - ìåòèëèðîâàííàÿ öåïü êÄÍÊ,          -íåìåòèëèðîâàííàÿ öåïü êÄÍÊ.

  1 ìêë 10-êðàòíîãî áóôåðà ëèãèðîâàíèÿ,

  1 ìêë 10 ìÌ ðATÔ,

  1 ìêë ôåðìåíòà ÄÍÊ ëèãàçû ôàãà Ò4 (4 å.à./ìêë).

          Ñìåñü èíêóáèðîâàëè ïðè 4îÑ â òå÷åíèå 2-õ ñóòîê, ïîñëå ÷åãî èíàêòèâèðîâàëè ëèãàçó ïðîãðåâàíèåì ïðè 70îÑ â òå÷åíèå 30 ìèí, îõëàæäàëè äî êîìíàòíîé òåìïåðàòóðû è äîáàâëÿëè êîìïîíåíòû äëÿ ôîñôîðèëèðîâàíèÿ êîíöåâûõ íóêëåîòèäîâ:

  1 ìêë 10-êðàòíîãî áóôåðà ëèãèðîâàíèÿ,

  2 ìêë 10 ìÌ ðATÔ,

  6 ìêë ñòåðèëüíîé âîäû,

  1 ìêë ôåðìåíòà ïîëèíóêëåîòèäíîé êèíàçû ôàãà Ò4 (10 å.à./ìêë).

          Ðåàêöèîííóþ ñìåñü èíêóáèðîâàëè ïðè 37îÑ â òå÷åíèå 30 ìèí. Çàòåì îõëàæäàëè äî êîìíàòíîé òåìïåðàòóðû è äîáàâëÿëè êîìïîíåíòû äëÿ îáðàçîâàíèÿ ëèïêèõ êîíöîâ ïî ñàéòó ðåñòðèêöèè ýíäîíóêëåàçû Xho I:

  28 ìêë áóôåðà 4,

  3 ìêë Xho I (40 å.à./ìêë).

          Ñìåñü èíêóáèðîâàëè ïðè 37îÑ â òå÷åíèå 1,5 ÷àñà. Çàòåì äîáàâëÿëè 5 ìêë 10-êðàòíîãî áóôåðà STE (1 Ì NaCl, 200 ìÌ òðèñ-HCl, ðÍ 7,5, 100 ìÌ Na2ÝÄÒÀ) è ïðîïóñêàëè ÷åðåç êîëîíêó ñ ãåëåì ñåôàêðèë Ñ-500. Ôðàêöèè, ñîäåðæàùèå ìîëåêóëû ñ ðàçìåðîì áîëåå 500 ïí îáúåäèíÿëè è ýêñòðàãèðîâàëè ÄÍÊ ðàâíûì îáúåìîì ñìåñè ôåíîë-õëîðîôîðì (1:1) è ðàâíûì îáúåìîì õëîðîôîðìà. Çàòåì äîáàâëÿëè äâîéíîé îáúåì ýòàíîëà, îñàæäàëè êÄÍÊ öåíòðèôóãèðîâàíèåì, ïðîìûâàëè 80% ýòàíîëîì è ðàñòâîðÿëè â 10 ìêë âîäû. Äëÿ ëèãèðîâàíèÿ áðàëè 5 ìêë ðàñòâîðà êÄÍÊ (600 íã) è 2 ìêë ðàñòâîðà âåêòîðà pBluescript KS(+) (1 ìêã), èìåþùåãî "ëèïêèå" äåôîñôîðèëèðîâàííûå êîíöû ïî ñàéòàì ðåñòðèêöèè ýíäîíóêëåàçàìè EcoR I è Xho I (ðèñ. 9).

Çàòåì äîáàâëÿëè 1 ìêë 10-êðàòíîãî áóôåðà 3, 1 ìêë 10 ìÌ ðàñòâîðà ðATÔ è 1 ìêë ôåðìåíòà ëèãàçû ôàãà Ò4 (4 å.à./ìêë). Ñìåñü èíêóáèðîâàëè ïðè 4îÑ â òå÷åíèå 2-õ ñóòîê, ïîñëå ÷åãî ýêñòðàãèðîâàëè ðàâíûìè îáüåìàìè ôåíîë-õëîðîôîðìà è õëîðîôîðìà.

          Àìïëèôèêàöèÿ áèáëèîòåêè.

          Ýëåêòðîòðàíñôîðìàöèþ ïðîâîäèëè êàê îïèñàíî â ï. Òðàíñôîðìàöèÿ ïðîêàðèîòè÷åñêèõ êëåòîê, ïîñëå ÷åãî âûñåâàëè 1/1000 îáúåìà (2,5 ìêë) ñðåäû SOC  íà ñåëåêòèâíóþ ñðåäó ñ àìïèöèëëèíîì (50 ìêã/ìë) äëÿ îïðåäåëåíèÿ êîëè÷åñòâà òðàíñôîðìèðîâàííûõ êëåòîê. Îñòàëüíóþ ÷àñòü ïîìåùàëè â 100 ìë ñðåäû LB ñ àìïèöèëëèíîì (50 ìêã/ìë) è èíêóáèðîâàëè ïðè 37îÑ ïðè ïåðåìåøèâàíèè äî òåõ ïîð, ïîêà îïòè÷åñêàÿ ïëîòíîñòü íå äîñòèãíåò âåëè÷èíû D550=2-2,5. Çàòåì îòáèðàëè 1,6õ1011 êëåòîê, îñàæäàëè èõ öåíòðèôóãèðîâàíèåì, ñóñïåíäèðîâàëè â 4 ìë ñðåäû LB è ïåðåìåøèâàëè ñ 4 ìë ãëèöåðèíà. Ïîëó÷åííóþ áèáëèîòåêó õðàíèëè ïðè -70îÑ.

            ÏÎËÈÌÅÐÀÇÍÀß ÖÅÏÍÀß ÐÅÀÊÖÈß

          Ðåàêöèîííàÿ ñìåñü ïîëèìåðàçíîé öåïíîé ðåàêöèè (ÏÖÐ) ñîäåðæàëà ñëåäóþùèå êîìïîíåíòû:

  100 íã ÄÍÊ ìàòðèöû,

  100 íã íåâûðîæäåííîãî ïðàéìåðà,

  500 íã âûðîæäåííîãî ïðàéìåðà,

  5 ìêë 2 ìÌ ðàñòâîðà äÍTÔ,

  5 ìêë 1-êðàòíîãî áóôåðà (10 ìÌ òðèñ-HCl, ðÍ 8,8, 50 ìÌ KCl, 1,5 ìÌ MgCl2, 0,001% æåëàòèí),

  1 ìêë Taq ïîëèìåðàçû,

  âîäà äî êîíå÷íîãî îáúåìà 50 ìêë (Dieffenbach and Dveksler, 1995).

           Òåìïåðàòóðíûé ðåæèì ÏÖÐ.

          Ðåàêöèîííóþ ñìåñü èíêóáèðîâàëè ïðè 95îÑ â òå÷åíèå 5 ìèí, ïîñëå ÷åãî äîáàâëÿëè Taq ïîëèìåðàçó è èñïîëüçîâàëè òåìïåðàòóðíûé ðåæèì, ïðè êîòîðîì â òå÷åíèå ïåðâûõ 18 öèêëîâ òåìïåðàòóðó îòæèãà ïðàéìåðîâ ïîíèæàëè íà 3îÑ ÷åðåõ êàæäûå òðè öèêëà:

1é-18é öèêëû      95îÑ -    1 ìèí    (äåíàòóðàöèÿ ÄÍÊ),

                      50-35îÑ - 1 ìèí   (îòæèã ïðàéìåðîâ),

                      72îÑ -     2 ìèí   (ïîëèìåðèçàöèÿ).

19-é-30-é öèêëû:  95îÑ     - 1 ìèí,

                      50îÑ -     1 ìèí,

                      72îÑ -     2 ìèí.

31-é öèêë:          95îÑ -     1 ìèí,

                      50îÑ -     1 ìèí,

                      72îÑ -    10 ìèí.

            ÑÓÁÊËÎÍÈÐÎÂÀÍÈÅ ÄÍÊ

          Ôðàãìåíòû ÄÍÊ, ïîëó÷åííûå â ðåçóëüòàòå ÏÖÐ, ðàçäåëÿëè â 1% àãàðîçíîì ãåëå è âûäåëÿëè êàê îïèñàíî â ï. Âûäåëåíèå ÄÍÊ èç ãåëÿ. Çàòåì îñàæäàëè ÄÍÊ ýòàíîëîì, ðàñòâîðÿëè â 5-10 ìêë âîäû è äîáàâëÿëè êîìïîíåíòû äëÿ óäàëåíèÿ âûñòóïàþùèõ íóêëåîòèäîâ ñ 3' êîíöà ÄÍÊ:

  1 ìêë 10-êðàòíîãî áóôåðà (200 ìÌ òðèñ-HCl, ðÍ 8,2, 100 ìÌ KÑl, 60 ìÌ (NH4)2SO4, 20 ìÌ MgCl2, 1% òðèòîí Õ-100 è 100 ìêã/ìë áû÷èé ñûâîðîòî÷íûé àëüáóìèí),

  1 ìêë 10 ìÌ dÍTÔ,

  1 ìêë Pfu ÄÍÊ ïîëèìåðàçû (2,5 å.à./ìêë),

  âîäó äî êîíå÷íîãî îáúåìà 10 ìêë.

          Ñìåñü èíêóáèðîâàëè 30 ìèí ïðè 72îÑ ïîñëå ÷åãî îõëàæäàëè äî 0îÑ è äîáàâëÿëè êîìïîíåíòû äëÿ ñøèâêè ñ âåêòîðîì pBluescript KS(+) ïî ñàéòó ðåñòðèêöèè Sma I:

  1 ìêë ðàñùåïëåííîãî âåêòîðà (0,5 ìêã),

  1 ìêë 10-êðàòíîãî áóôåðà (50 ìÌ òðèñ-HCl, ðÍ 7,5, 7 ìÌ MgCl2, 1 ìÌ ÄÒÒ),

  1 ìêë 10 ìÌ äATÔ,

  1 ìêë ÄÍÊ ëèãàçû ôàãà Ò4 è âîäó äî êîíå÷íîãî îáúåìà 10 ìêë.

          Ñìåñü èíêóáèðîâàëè îäíè ñóòêè ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå è çàòåì èñïîëüçîâàëè äëÿ õèìè÷åñêîé òðàíñôîðìàöèè êëåòîê E.coli. Òðàíñôîðìèðîâàííûå êëåòêè âûñåâàëè íà ñåëåêòèâíóþ ñðåäó: 1,5% LB-àãàð ñ àìïèöèëëèíîì (50 ìêã/ìë), òåòðàöèêëèíîì (15 ìêã/ìë), ÈÏÒà (2 ìÌ), X-Gal (500 ìêã/ìë) è èíêóáèðîâàëè 14 ÷àñîâ ïðè 37îÑ. Ïîñëå ýòîãî îòáèðàëè êîëîíèè áåëîãî öâåòà (Ìàíèàòèñ è äð., 1984; Dieffenbach and Dveksler, 1995).

            ÑÊÐÈÍÈÍà ÁÈÁËÈÎÒÅÊÈ êÄÍÊ

          Áèáëèîòåêó êÄÍÊ âûñåâàëè íà ÷àøêè Ïåòðè ñ 1,5% LB-àãàðîì ñ àìïèöèëëèíîì (50 ìêã/ìë) èç ðàñ÷åòà 4000 êîëîíèé íà ÷àøêó è èíêóáèðîâàëè ïðè 37îÑ äî òåõ ïîð ïîêà êîëîíèè íå äîñòèãíóò 0,5-1 ìì â äèàìåòðå. Êîëîíèè ïåðåíîñèëè íà íåéëîíîâóþ ìåìáðàíó è èíêóáèðîâàëè ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå â äåíàòóðèðóþùåì ðàñòâîðå (0,5 Ì NaOH, 1,5 Ì NaCl) â òå÷åíèå 7 ìèí è äâà ðàçà ïî 2 ìèí â íåéòðàëèçóþùåì ðàñòâîðå (1,5 Ì NaCl, 0,5 Ì òðèñ-HCl, ðÍ 7,5). Çàòåì ñïîëàñêèâàëè ìåìáðàíó â 2-êðàòíîì áóôåðå SSC (0,3 Ì NaCl, 0,03 Ì öèòðàò íàòðèÿ), âûñóøèâàëè è ôèêñèðîâàëè ÄÍÊ â òå÷åíèå 10 ìèí óëüòðàôèîëåòîâûì èçëó÷åíèåì ñ äëèíîé âîëíû 310 íì. Ïîñëå ýòîãî ìåìáðàíó ïîìåùàëè â 50 ìë ïðåäãèáðèäèçàöèîííîãî ðàñòâîðà (ðàñòâîð 1), ñîäåðæàùåãî:

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7