Клонирование и анализ генов легких цепей иммуноглобулинов стерляди

Клонирование и анализ генов легких цепей иммуноглобулинов стерляди

          Ó ñîìèêà è ðàäóæíîé ôîðåëè, ïðåäñòàâèòåëåé êîñòèñòûõ ðûá, îðãàíèçàöèÿ ãåíîâ L-öåïåé è Í-öåïåé îòëè÷àåòñÿ. Ãåíû Í-öåïåé êîñòèñòûõ ðûá îðãàíèçîâàíû ïîäîáíî ìëåêîïèòàþùèì ñåãìåíòàðíî (Bengten et al., 1991). Îðãàíèçàöèÿ ãåíîâ L-öåïåé èìååò êëàñòåðíûé õàðàêòåð.  òî æå âðåìÿ, â îòëè÷èå îò õðÿùåâûõ ðûá, òðàíñêðèïöèîííàÿ îðèåíòàöèÿ V ãåíîâ ó íèõ èçìåíåíà.

          Ñëåäóåò îòìåòèòü, ÷òî ñîìîâûå è ëîñîñåâûå ÿâëÿþòñÿ äîâîëüíî ñïåöèàëèçèðîâàííîé ãðóïïîé, âîçíèêøåé â ýâîëþöèè îòíîñèòåëüíî íåäàâíî (Ðèñ. 8). Îñîáåííîñòè îðãàíèçàöèè ãåíîâ ëåãêèõ öåïåé ó ýòèõ òàêñîíîâ ìîãóò ïðåäñòàâëÿòü ñîáîé íîâîïðèîáðåòåííûå ïðèçíàêè (Romer, 1966).

           ñâÿçè ñ ýòèì îñîáûé èíòåðåñ ïðåäñòàâëÿåò èçó÷åíèå ñòðóêòðû è îðãàíèçàöèè ãåíîâ L-öåïåé Èà ó êîñòíî-õðÿùåâûõ ðûá. Êîñòíî-õðÿùåâûå ÿâëÿþòñÿ àðõàè÷íîé ãðóïïîé êîñòèñòûõ ðûá, âîçíèêøåé çíà÷èòåëüíî ðàíüøå íàñòîÿùèõ êîñòèñòûõ. Íåñìîòðÿ íà òî, ÷òî ñóùåñòâóþò ðàçëè÷íûå ìíåíèÿ îòíîñèòåëüíî ïîñëåäîâàòåëüíîñòè ïîÿâëåíèÿ êîñòíî-õðÿùåâûõ è äâîÿêîäûøàùèõ (ïðåäêîâ íàçåìíûõ ïîçâîíî÷íûõ) (Ðîìåð è Ïàðñîíñ, 1992; Þäêèí È. È., 1941), î÷åâèäíî, ÷òî êîñòíî-õðÿùåâûå â áîëüøåé ñòåïåíè ÷åì êîñòèòñòûå ñîõðàíèëè ÷åðòû äðåâíèõ ïåðâè÷íî-êîñòíûõ ðûá è, ñîîòâåòñòâåííî, ñ áîëüøèì îñíîâàíèåì ìîãóò ðàññìàòðèâàòüñÿ êàê ïðîìåæóòî÷íîå çâåíî ìåæäó õðÿùåâûìè ðûáàìè è àìôèáèÿìè.

          Ðèñ. 8. Ýâîëþöèîííîå äðåâî íèçøèõ ïîçâîíî÷íûõ ( ïî Ñåâåðöåâó À. Í., 1939).

          Îáîçíà÷åíèÿ:    - òàêñîíû, èìåþùèå íûíå æèâóùèõ ïðåäñòàâèòåëåé,     - òàêñîíû, ñóùåñòâîâàíèå êîòîðûõ äîêàçàíî ïàëåîíòîëîãè÷åñêèìè èññëåäîâàíèÿìè.

ÌÀÒÅÐÈÀËÛ È ÌÅÒÎÄÛ

            ÝËÅÊÒÐÎÔÎÐÅÇ ÄÍÊ

          Â àãàðîçíîì ãåëå.

          Ýëåêòðîôîðåç ÄÍÊ ïðîâîäèëè â 1% àãàðîçíîì ãåëå â 1-êðàòíîì áóôåðå ÒÀÅ, èìåþùåì ñîñòàâ: 0.04 Ì òðèñ-àöåòàò, 2 ìÌ Na2ÝÄÒÀ (Ìàíèàòèñ è äð., 1984).

          Â ïîëèàêðèëàìèäíîì ãåëå.

          Ýëåêòðîôîðåç ÄÍÊ ïðîâîäèëè â 6% ïîëèàêðèëàìèäíîì ãåëå â 0,5-êðàòíîì áóôåðå ÒÁÅ, èìåþùåì ñîñòàâ: 0,089 Ì òðèñ-áîðàò, 0,089 Ì áîðíàÿ êèñëîòà, 2 ìÌ Na2ÝÄÒÀ. Äëÿ ïîëèìåðèçàöèè ãåëÿ ê 50 ìë ðàñòâîðà äîáàâëÿëè 300 ìêë 10% ðàñòâîðà ïåðñóëüôàòà àììîíèÿ è 30 ìêë ÒÅÌÅÄ (Ìàíèàòèñ è äð., 1984).

            ÂÛÄÅËÅÍÈÅ ÄÍÊ ÈÇ ÃÅËß

          Àäñîðáöèÿ íà äèýòèëàìèíîýòèëöåëëþëîçå.

          Ãåëü îêðàøèâàëè â ðàñòâîðå áðîìèñòîãî ýòèäèÿ, ó÷àñòîê ãåëÿ ñ ïîëîñîé ÄÍÊ âûðåçàëè, ïîìåùàëè â êàìåðó è ïåðåíîñèëè ÄÍÊ íà äèýòèëàìèíîýòèëöåëëþëîçó â 0,5-êðàòíîì áóôåðå ÒÁÅ (ñì. Ýëåêòðîôîðåç ÄÍÊ (2)) ïðè íàïðÿæåíèè 40 Â/ñì. Ýëþöèþ ÄÍÊ ñ äèýòèëàìèíîýòèëöåëëþëîçû ïðîâîäèëè ïóòåì èíêóáèðîâàíèÿ â òå÷åíèå 30 ìèí ïðè 70îÑ â áóôåðå, èìåþùåì ñîñòàâ: 2 ìÌ NaCl, 1 ìÌ Na2ÝÄÒÀ, 40 ìÌ òðèñ ðÍ 8,0 (Ìàíèàòèñ è äð., 1984).

          Àäñîðáöèÿ íà êðåìíèåâîé ïóäðå.

          Àãàðîçíûé ãåëü îêðàøèâàëè â ðàñòâîðå áðîìèñòîãî çòèäèÿ, âûðåçàëè ó÷àñòîê ãåëÿ ñ ÄÍÊ è ðàñïëàâëÿëè èíêóáèðîâàíèåì ñ äâîéíûì îáúåìîì 6 Ì ðàñòâîðà KI â òå÷åíèå 10 ìèí ïðè 55îÑ. Çàòåì äîáàâëÿëè ñóñïåíçèþ êðåìíèåâîé ïóäðû (ñèëèêè) â 3 Ì ðàñòâîðå KI â êîíöåíòðàöèè 100 ìã/ìë èç ðàñ÷åòà 300 ìêã ñèëèêè íà 1 ìêã ÄÍÊ è èíêóáèðîâàëè â òå÷åíèå 2 ìèí ïðè 55îÑ. Ïîñëå ýòîãî îñàæäàëè ñèëèêó öåíòðèôóãèðîâàíèåì ïðè 2000 g â òå÷åíèå 2 ìèí è äâàæäû ïðîìûâàëè ñóñïåíäèðîâàíèåì â ðàñòâîðå, ñîäåðæàùåì 50 ìÌ NaCl, 10 ìÌ òðèñ-HCl, ðÍ 8,0, 2,5 ìÌ Na2ÝÄÒÀ è 50% ýòèëîâûé ñïèðò. Ýëþèðîâàëè ÄÍÊ ñ ñèëèêè ñóñïåíäèðîâàíèåì â âîäå (Boyle, Lew, 1995).

          Çàìîðàæèâàíèå - îòòàèâàíèå.

          Àãàðîçíûé ãåëü ñ ÄÍÊ  10 ìèí èíêóáèðîâàëè â æèäêîì àçîòå è îñàæäàëè öåíòðèôóãèðîâàíèåì ïðè 12000 g â òå÷åíèå 15 ìèí, ïîñëå ÷åãî äîáàâëÿëè ê ñóïåðíàòàíòó 1/10 îáúåìà 3 Ì NaAc, 2 îáúåìà ýòàíîëà è îñàæäàëè ÄÍÊ ïðè 12000 g â òå÷åíèå 10 ìèí.

            ÏÎËÓ×ÅÍÈÅ ÐÀÄÈÎÀÊÒÈÂÍÛÕ ÇÎÍÄÎÂ

          500 íã ÄÍÊ-ìàòðèöû è 100 íã ïðàéìåðà äåíàòóðèðîâàëè â 10 ìêë âîäû ïðè 100îÑ â òå÷åíèå 10 ìèí è áûñòðî îõëàæäàëè äî 0îÑ. Çàòåì äîáàâëÿëè 10 ìêë 10-êðàòíîãî áóôåðà (40 ìÌ KP04 ðÍ 7,5, 6,6 ìÌ MgCl2 è 1,0 ìÌ 2-ìåðêàïòîýòàíîë), 0,1-0,5 ìÊè 32Ð-dATÔ, 10 ìêë 2 ìÌ ðàñòâîðà òðåõ äðóãèõ íåìå÷åíûõ äÍTÔ äî êîíöåíòðàöèè 200 ìêÌ. Îáúåì ðåàêöèîííîé ñìåñè äîâîäèëè âîäîé äî 100 ìêë, äîáàâëÿëè 3 ìêë ôðàãìåíòà Êëåíîâà ÄÍÊ-ïîëèìåðàçû I (10-12 å.à.) è èíêóáèðîâàëè ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå â òå÷åíèå 30 ìèí. Î÷èñòêó çîíäà ïðîâîäèëè ìåòîäîì ãåëü - ôèëüòðàöèè íà êîëîíêå ñ áèîãåëåì Ï-10 (Ìàíèàòèñ è äð., 1984).

            ÂÛÄÅËÅÍÈÅ ÏËÀÇÌÈÄÍÎÉ ÄÍÊ

          Êëåòêè Escherichia coli, âûðàùåííûå â ñðåäå Ëóðèà-Áåðòàíè (1% NaCl, 1% áàêòî-òðèïòîí, 0,5% áàêòî-äðîææåâîé ýêñòðàêò, ðÍ 7,5) (ñðåäà LB) ñ àìïèöèëëèíîì (50 ìêã/ìë), îñàæäàëè öåíòðèôóãèðîâàíèåì ïðè 4000 g. Çàòåì îñàäîê ñóñïåíäèðîâàëè â áóôåðå STET (8% ñàõàðîçà, 0,5% òðèòîí X-100, 10 ìÌ òðèñ-HCl è 50 ìÌ Na2ÝÄÒÀ, ðÍ 8,0) è äîáàâëÿëè ëèçîöèì äî êîíöåíòðàöèè 0,8 ã/ìë. Ñìåñü èíêóáèðîâàëè ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå â òå÷åíèå 5 ìèí è ïðè 100îÑ â òå÷åíèå 1 ìèí. Ïîñëå ýòîãî êëåòî÷íûé äåáðèñ îñàæäàëè öåíòðèôóãèðîâàíèåì ïðè 16000 g â òå÷åíèå 15 ìèí.

          Äëÿ îñàæäåíèÿ ïëàçìèäíîé ÄÍÊ ê ñóïåðíàòàíòó äîáàâëÿëè 1/10 îáúåìà 3 Ì ðàñòâîðà àöåòàòà íàòðèÿ, ðàâíûé îáúåì èçîïðîïàíîëà è öåíòðèôóãèðîâàëè ïðè 16000 g â òå÷åíèå 15 ìèí ïðè 20îÑ. Çàòåì ïðîìûâàëè îñàäîê äîáàâëåíèåì 80% ýòàíîëà è ïîâòîðíûì öåíòðèôóãèðîâàíèåì â òå÷åíèå 5 ìèí ïðè 20îÑ (Ìàíèàòèñ è äð., 1984).

            Î×ÈÑÒÊÀ ÏËÀÇÌÈÄÍÎÉ ÄÍÊ ÌÅÒÎÄÎÌ ÐÀÂÍÎÂÅÑÍÎÃÎ ÖÅÍÒÐÈÔÓÃÈÐÎÂÀÍÈß Â ÃÐÀÄÈÅÍÒÅ ÏËÎÒÍÎÑÒÈ CsCl

          Íà êàæäûå 10 ìë ðàñòâîðà ïëàçìèäíîé ÄÍÊ, ïîëó÷åííîãî ïîñëå îñàæäåíèÿ ëèçèðîâàííûõ êëåòîê (ñì. Âûäåëåíèå ïëàçìèäíîé ÄÍÊ), äîáàâëÿëè 1 ã ñóõîãî CsCl, ñîëü ðàñòâîðÿëè, ïîñëå ÷åãî íà êàæäûå 10 ìë ðàñòâîðà äîáàâëÿëè 0,8 ìë ðàñòâîðà áðîìèñòîãî ýòèäèÿ ñ êîíöåíòðàöèåé 10 ìã/ìë. Ñìåñü ïîìåùàëè â öåíòðèôóæíûå ïðîáèðêè Beckman, çàïîëíÿëè äîâåðõó ðàñòâîðîì CsCl è áðîìèñòîãî ýòèäèÿ òîé æå ïëîòíîñòè è öåíòðèôóãèðîâàëè â ðîòîðå Ti 60 ïðè 45000 îá/ìèí è òåìïåðàòóðå 20îÑ â òå÷åíèå 36 ÷àñîâ. Ïîñëå ýòîãî îòáèðàëè êîëüöåâóþ êîâàëåíòíî çàìêíóòóþ ïëàçìèäíóþ ÄÍÊ è ýêñòðàãèðîâàëè áðîìèñòûé ýòèäèé èç ðàñòâîðà äî ïîëíîãî îáåñöâå÷èâàíèÿ ðàâíûì îáúåìîì í-áóòàíîëà, ïðåäâàðèòåëüíî íàñûùåííîãî 1 Ì ðàñòâîðîì NaCl.

ÄÍÊ îñàæäàëè öåíòðèôóãèðîâàíèåì ïðè 15000 g, äîáàâèâ ðàâíûé îáúåì 1 Ì ðàñòâîðà NH4Cl è äâà îáúåìà ýòàíîëà. Ïîñëå ïðîìûâàíèÿ ýòàíîëîì îñàäîê ÄÍÊ ðàñòâîðÿëè â âîäå äî êîíöåíòðàöèè 1 ìêã/ìêë (Ìàíèàòèñ è äð., 1984).

            ÒÐÀÍÑÔÎÐÌÀÖÈß ÏÐÎÊÀÐÈÎÒÈ×ÅÑÊÈÕ ÊËÅÒÎÊ

          Õèìè÷åñêàÿ òðàíñôîðìàöèÿ.

          Äëÿ ïîäãîòîâêè êîìïåòåíòíûõ êëåòîê E.coli øòàìì XL-1 Blue MRF ' è âûðàùèâàëè â 100 ìë 2-êðàòíîé ñðåäû Ëóðèà (2% áàêòî-òðèïòîí, 1% áàêòî-äðîææåâîé ýêñòðàêò, 0,1% NaCl, 0,4% ãëþêîçà, ðÍ 7,0) ïðè 37îÑ äî îïòè÷åñêîé ïëîòíîñòè D550=0,35. Êëåòî÷íóþ ñóñïåíçèþ âûäåðæèâàëè ïðè 0îÑ â òå÷åíèå 2 ÷àñîâ. Çàòåì êëåòêè îñàæäàëè öåíòðèôóãèðîâàíèåì ïðè 4000 g, òåìïåðàòóðå 4îÑ è ñóñïåíäèðîâàëè â 50 ìë ëåäÿíîãî áóôåðà À (100 ìÌ CaCl2, 70 ìÌ MnCl2, 40 ìÌ NaAc, ðÍ 5,5). Ïîñëå ýòîãî ñóñïåíçèþ êëåòîê âûäåðæèâàëè ïðè 0îÑ â òå÷åíèå 30 ìèí, ïîñëå ÷åãî êëåòêè îñàæäàëè è ñóñïåíäèðîâàëè â 5 ìë áóôåðà À ñ 15% ãëèöåðèíà.

          Äëÿ òðàíñôîðìàöèè ê 200 ìêë ñóñïåíçèè êîìïåòåíòíûõ êëåòîê äîáàâëÿëè 30 íã ïëàçìèäíîé ÄÍÊ, ðàñòâîðåííîé â 100 ìêë âîäû è âûäåðæèâàëè ïðè 0îÑ â òå÷åíèå 30 ìèí. Çàòåì èíêóáèðîâàëè ïðè 37îÑ â òå÷åíèå 5 ìèí, ïîñëå ÷åãî äîáàâëÿëè 3 ìë ñðåäû LB è èíêóáèðîâàëè ïðè 37îÑ åùå 90 ìèí. Êëåòêè ñîáèðàëè öåíòðèôóãèðîâàíèåì è âûñåâàëè íà ñåëåêòèâíóþ ñðåäó (Ìàçèí è äð., 1988).

          Ýëåêòðîòðàíñôîðìàöèÿ.

          Äëÿ ïîäãîòîâêè êîìïåòåíòíûõ êëåòîê E.coli øòàìì XL-1 Blue MRF ' âûðàùèâàëè â 100 ìë ñðåäû LB (ñì. Õèìè÷åñêàÿ òðàíñôîðìàöèÿ) ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå äî îïòè÷åñêîé ïëîòíîñòè D550=0,45. Çàòåì êëåòêè îñàæäàëè öåíòðèôóãèðîâàíèåì ïðè 4000 g, 4îÑ è ïðîìûâàëè ñóñïåíäèðîâàíèåì ïîñëåäîâàòåëüíî â 100 ìë, 50 ìë è 10ìë 10% ðàñòâîðà ãëèöåðèíà ïðè 0-4îÑ. Ïîñëå ýòîãî êëåòêè ñóñïåíäèðîâàëè â 240 ìêë ëåäÿíîãî ðàñòâîðà GYT (10% ãëèöåðèí, 0,125% áàêòî-äðîææåâîé ýêñòðàêò, 0,25% áàêòî-òðèïòîí).

          Äëÿ òðàíñôîðìàöèè ê 40 ìêë ñóñïåíçèè êîìïåòåíòíûõ êëåòîê äîáàâëÿëè 1 ìêë ÄÍÊ âåêòîðà (50 íã) ïðè 0-4îÑ è ïðîïóñêàëè ýëåêòðè÷åñêèé ðàçðÿä (U=18000 Â). Çàòåì äîáàâëÿëè 1 ìë SOC (2% áàêòî-òðèïòîí, 0,5% áàêòî-äðîææåâîé ýêñòðàêò, 10 ìÌ NaCl, 2,5 ìÌ KCl, 10 ìÌ MgCl2, 10 ìÌ MgSO4, 20 ìÌ ãëþêîçà), ïåðåìåøèâàëè, ïåðåíîñèëè â 3 ìë ñðåäû SOC, ïðîãðåòîé äî 42îÑ, è èíêóáèðîâàëè ïðè 37îÑ â òå÷åíèå 1 ÷àñà (Wai Lin Tung and King-C. Chow, 1995).

            ÂÛÄÅËÅÍÈÅ ËÅÉÊÎÖÈÒÎÂ ÈÇ ÊÐÎÂÈ ÐÛÁ

          Êðîâü ñîáèðàëè íà õîëîäó ÷åðåç êàóäàëüíóþ àðòåðèþ ñ äîáàâëåíèåì íà êàæäûå 5 ìë êðîâè 1 ìë 2,7% ðàñòâîðà Na2ÝÄÒÀ, ðÍ 7,4. Ê âûäåëåííîé êðîâè äîáàâëÿëè ðàâíûé îáúåì òðèñ-ñîëåâîãî áóôåðà (TBS) (0,14 Ì NaCl, 5 ìÌ KCl, 25 ìÌ òðèñ-HCl, ðÍ 7,4). Ñìåñü íàíîñèëè ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå íà ðàâíûé îáúåì ñðåäû äëÿ âûäåëåíèÿ ëåéêîöèòîâ, ñîäåðæàùåé 24 ÷àñòè 9% ôèêîëà è 10 ÷àñòåé 34% âåðîãðàôèíà. Ïîñëå öåíòðèôóãèðîâàíèÿ ïðè 400 g â òå÷åíèå 30 ìèí îòáèðàëè ñëîé ëåéêîöèòîâ è ðàçâîäèëè â áîëüøîì îáúåìå áóôåðà TBS. Ïîñëå ïîâòîðíîãî öåíòðèôóãèðîâàíèÿ ïðè 300 g â òå÷åíèå 40 ìèí äëÿ ëèçèñà îñòàòî÷íûõ ýðèòðîöèòîâ êëåòêè ñóñïåíäèðîâàëè â ðàñòâîðå, ñîäåðæàùåì 9 îáúåìîâ 0,83% ðàñòâîðà NH4Cl è 1 îáúåì 2,06% ðàñòâîðà òðèñ-HCl, ðÍ 7,62, äî êîíöåíòðàöèè 108 êë/ìë è äîáàâëÿëè 5 îáúåìîâ ñðåäû. Ïîñëå îñàæäåíèÿ êëåòîê ïðè 300 g â òå÷åíèå 10 ìèí ïðîöåäóðó î÷èñòêè ïîâòîðèëè (Ôðèìåëü, 1987).

            ÂÛÄÅËÅÍÈÅ ÑÓÌÌÀÐÍÎÉ ÐÍÊ ÈÇ ËÅÉÊÎÖÈÒÎÂ

          Îñàäîê ëåéêîöèòîâ ïîñëå âûäåëåíèÿ è î÷èñòêè ñóñïåíäèðîâàëè â 10 îáúåìàõ (1 ìë) ðàñòâîðà 1, ñîäåðæàùåãî 4 Ì ãóàíèäèí òèîöèàíàò, 25 ìÌ öèòðàò íàòðèÿ, ðÍ 7,0, 0,5% ñàðêîçèë è 0,1 Ì 2-ìåðêàïòîýòàíîë, ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå. Çàòåì äîáàâëÿëè 0,1 ìë 2 Ì ðàñòâîðà NaAc, ðÍ 4,0, 1 ìë ôåíîëà, 0,2 ìë õëîðîôîðìà è ïåðåìåøèâàëè. Çàòåì öåíòðèôóãèðîâàëè ïðè 10000 g â òå÷åíèå 20 ìèí ïðè 4îÑ, îòáèðàëè âîäíóþ ôàçó, äîáàâëÿëè ê íåé ðàâíûé îáúåì èçîïðîïàíîëà è îñàæäàëè ÐÍÊ öåíòðèôóãèðîâàíèåì ïðè 15000 g â òå÷åíèå 15 ìèí ïðè 4îÑ (Chomczynski and Sacchi, 1987).

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7