Клонирование и анализ генов легких цепей иммуноглобулинов стерляди

Клонирование и анализ генов легких цепей иммуноглобулинов стерляди

          Îáîçíà÷åíèÿ:    - ñèãíàëüíûå îëèãîìåðû.

          Ïîñëåäîâàòåëüíîñòü, â êîòîðîé ðåêîìáèíèðóþò ëîêóñû L-öåïåé, ñòðîãî óïîðÿäî÷åíà âî âðåìåíè. Ïîêàçàíî, ÷òî ïåðâûìè ïåðåñòðàèâàþòñÿ ëîêóñû êàïïà òèïà, ïðè÷åì åñëè â îäíîé õðîìîñîìå ïåðåñòðîéêà îêàçàëàñü íåôóíêöèîíàëüíîé, òîåñòü íå ïðèâåëà ê ïîÿâëåíèþ ïîëíîöåííîãî ãåíà, òî ðåêîìáèíàöèÿ ïðîèñõîäèò â êàïïà ëîêóñå íà ãîìîëîãè÷íîé õðîìîñîìå.  ñëó÷àå ïîâòîðíîé àáîðòèâíîé ïåðåñòðîéêè àíàëîãè÷íî ïðîèñõîäÿò ïåðåñòðîéêè â ëÿìáäà ëîêóñàõ. Åñëè â êëåòêå íåïðîäóêòèâíî ïåðåñòðîèëèñü âñå ÷åòûðå ëîêóñà, òî îíà ïðåâðàùàòñÿ â 0-êëåòêó è ïîäâåðãàåòñÿ àïîïòîçó. Åñëè æå ïåðåñòðîéêà îäíîãî èç ëîêóñîâ ïðèâåëà ê îáðàçîâàíèþ ôóíêöèîíàëüíîãî ãåíà, òî ðåêîìáèíàöèÿ îñòàëüíûõ ëîêóñîâ áëîêèðóåòñÿ. Äåòàëè ìåõàíèçìà áëîêèðîâàíèÿ íåèçâåñòíû, îäíàêî óñòàíîâëåíî, ÷òî íåîáõîäèìûì óñëîâèåì äëÿ íåãî ÿâëÿåòñÿ òðàíñêðèïöèÿ ïðîäóêòèâíî ïåðåñòðîåííîãî ãåíà.  ðåçóëüòàòå â êàæäîì èíäèâèäóàëüíîì ëèìôîöèòå ñèíòåçèðóåòñÿ òîëüêî îäèí òèï L-öåïåé, êàïïà èëè ëÿìáäà, è ýêñïðåññèÿ ãåíà ïðîèñõîäèò òîëüêî íà îäíîé èç äâóõ ãîìîëîãè÷íûõ õðîìîñîì. Ýòè ôåíîìåíû, íàçûâàåìûå èçîòèïè÷åñêèì è àëëåëüíûì èñêëþ÷åíèÿìè ëåæàò â îñíîâå êëþ÷åâîãî ïðèíöèïà ôóíêöèîíèðîâàíèÿ èììóííîé ñèñòåìû - ïðèíöèïà êëîíàëüíîé ñåëåêöèè (Ïîë, 1987; Strob, 1987).

           îðãàíèçìå ìëåêîïèòàþùèõ ãåíåðèðóåòñÿ ñâûøå äåñÿòè ìèëëèîíîâ âàðèàíòîâ àíòèòåë, õîòÿ â ãåíîìå ñîäåðæèòñÿ çíà÷èòåëüíî ìåíüøåå êîëè÷åñòâî ãåííûõ ñåãìåíòîâ, êîòîðûå ìîãóò ó÷àñòâîâàòü â ôîðìèðîâàíèè âàðèàáåëüíûõ äîìåíîâ.  ñëó÷àå L-öåïåé, îñíîâíûì èñòî÷íèêîì ðàçíîîáðàçèÿ ÿâëÿåòñÿ êîìáèíàòèâíîå ñî÷åòàíèå V è J ñåãìåíòîâ. Äîïîëíèòåëüíûì èñòî÷íèêîì ÿâëÿåòñÿ ñìåùåíèå ðåêîìáèíàöèîííîé ðàìêè â ìåñòå èõ ñîåäèíåíèÿ. Êðîìå òîãî, V ãåííûå ñåãìåíòû ìîãóò îáìåíèâàòüñÿ ó÷àñòêàìè ÄÍÊ ñ ïñåâäîãåíàìè ïîñðåäñòâîì ãåííîé êîíâåðñèè. Î÷åíü ñóùåñòâåííûé âêëàä â ðàçíîîáðàçèå ñïåöèôè÷íîñòåé àíòèòåë âíîñèò ñîìàòè÷åñêîå ìóòèðîâàíèå âàðèàáåëüíûõ ãåííûõ ñåãìåíòîâ â ñàéòàõ, ó÷àñòâóþùèõ â ôîðìèðîâàíèè àíòèãåíñâÿçûâàþùåãî öåíòðà. Ñîìàòè÷åñêîå ðàçíîîáðàçèå ãåíåðèðóåòñÿ ïðè âòîðè÷íîì èììóííîì îòâåòå ïóòåì âêëþ÷åíèÿ ãèïåðìóòàöèîííîãî ìåõàíèçìà â êëåòêàõ ïàìÿòè â çàðîäûøåâûõ öåíòðàõ ëèìôàòè÷åñêèõ óçëîâ (Tonegawa 1983; Roitt et al., 1993).

            ÃÅÍÎÌÍÀß ÎÐÃÀÍÈÇÀÖÈß È ÝÊÑÏÐÅÑÑÈß ÃÅÍΠL-ÖÅÏÅÉ ÈÃ Ó ÍÈÇØÈÕ ÏÎÇÂÎÍÎ×ÍÛÕ

          Õðÿùåâûå ðûáû.

          Ãóìîðàëüíûé èììóííûé îòâåò â âèäå ñïåöèôè÷åñêèõ àíòèòåë îáíàðóæèâàåòñÿ òîëüêî ó ïîçâîíî÷íûõ. Íàèáîëåå ïðèìèòèâíûìè âèäàìè, ó êîòîðûõ îáíàðóæåíà ñïîñîáíîñòü ñèíòåçèðîâàòü ÈÃ, ÿâëÿþòñÿ õðÿùåâûå ðûáû. Ïðåäñòàâèòåëè òðåõ îñíîâíûõ òàêñîíîâ (àêóëû, ñêàòû è õèìåðû) ïðîäóöèðóþò àíòèòåëà â îòâåò íà ââåäåíèå øèðîêîãî ñïåêòðà àíòèãåíîâ. Îäíàêî, â îòëè÷èå îò ìëåêîïèòàþùèõ, ãåòåðîãåííîñòü ñûâîðîòî÷íûõ àíòèòåë ó õðÿùåâûõ ðûá âûðàæåíà î÷åíü ñëàáî. Êðîìå òîãî, ó íèõ íå îáíàðóæåíî ñîçðåâàíèå èììóííîãî îòâåòà - ïðè âòîðè÷íîì ââåäåíèè àíòèãåíà ñïåêòð àíòèòåë íå ìåíÿåòñÿ (Flajnik, 1996). Ðåçóëüòàòû èññëåäîâàíèé ïîñëåäíèõ ëåò ïðîäåìîíñòðèðîâàëè, ÷òî îðãàíèçàöèÿ ãåíîâ Èà ó õðÿùåâûõ ðûá òàêæå èìååò ÿðêî âûðàæåííûå îñîáåííîñòè.

          Ó õðÿùåâûõ ðûá îáíàðóæåíû ãåíû òðåõ òèïîâ L-öåïåé, ëîêàëèçóþùèåñÿ â ðàçíûõ ëîêóñàõ. Â êàæäîì ëîêóñå ãåíûå ñåãìåíòû îðãàíèçîâàíû â êëàñòåðû, èìåþùèå ïî îäíîìó V, J è C ãåííîìó ñåãìåíòó (ðèñ. 4). Òàêèõ êëàñòåðîâ ñîäåðæèòñÿ íåñêîëüêî äåñÿòêîâ èëè äàæå ñîòåí â îäíîì ëîêóñå íà ðàññòîÿíèè 12-15 òïí äðóã îò äðóãà (Rast et al., 1994).

          Ãåíû ïåðâîãî òèïà íàéäåíû ó ðàçíîçóáîé àêóëû (Heterodontus francisci) (Shamblott and Litman, 1989) è ìàëîãî ñêàòà (Raja erinacea) (Anderson et al., 1995). Ó àêóëû êëàñòåðû èìåþò ðàçìåð 3-6 òïí. V è J, J è C ãåííûå ñåãìåíòû ðàçäåëåíû ïðèìåðíî 0,5 è 4 òïí ñîîòâåòñòâåííî. Ó ñêàòà V è J ñåãìåíòû ñëèòû â çàðîäûøåâîé ÄÍÊ.

          Ãåíû âòîðîãî òèïà îáíàðóæåíû ó ïÿòíèñòîé õèìåðû (Hydrolagus colliei) (Maisey, 1984), ïåñ÷àíîé àêóëû (Carcharhinus plumbeus) (Hohman et al., 1992; Hohman et al., 1993), ðàçíîçóáîé àêóëû è ìàëîãî ñêàòà (Ó âñåõ èçó÷åííûõ âèäîâ â êëàñòåðàõ ýòîãî òèïà V è J ãåííûå ñåãìåíòû ñîåäèíåíû óæå â çàðîäûøåâîì ãåíîìå. V è C ãeííûå ñåãìåíòû ðàçäåëåíû 2-3 òïí.

          Ðèñ. 4. Ñõåìà ñòðîåíèÿ ëîêóñîâ ãåíîâ L-öåïåé ÈÃ ó àêóëû.

          Îðãàíèçàöèÿ ãåíîâ ó àêóëû èìååò êëàñòåðíûé òèï. Êàæäûé êëàñòåð èìååò ðàçìåð 3 - 6 òïí è ñîäåðæèò ïî îäíîìó VL, JL è CL ãåííîìó ñåãìåíòó.

          Îáíàðóæåíî òðè òèïà ãåíîâ L-öåïåé ÈÃ. Ëîêóñû ãåíîâ ïåðâîãî è òðåòüåãî òèïîâ èìåþò ñõîæóþ îðãàíèçàöèþ.  ýòîì ñëó÷àå VL è JL, JL è CL ñåãìåíòû ðàçäåëåíû ïðèìåðíî 0,5 è 4 òïí ñîîòâåòñòâåííî (À) (Rast et al., 1994).

          Â ëîêóñå ãåíîâ âòîðîãî òèïà VL è JL ñåãìåíòû ñîåäèíåíû óæå â çàðîäûøåâîì ãåíîìå (Á).

          Òðåòèé òèï ãåíîâ L-öåïåé íàéäåí ó àêóëû-íÿíüêè (Gynglimostoma cirratum) (Greenberg et al., 1993) è ðàçíîçóáîé àêóëû (Rast et al., 1994).  êëàñòåðàõ ýòîãî òèïà V è J, J è C ãåííûå ñåãìåíòû ðàçäåëåíû, êàê è â êëàñòåðàõ ïåðâîãî òèïà, ïðèìåðíî 0,5 è 4 òïí ñîîòâåòñòâåííî. V è J ãåííûå ñåãìåíòû ôëàíêèðóþòñÿ ñàéòàìè ñïåöèôè÷åñêîé ðåêîìáèíàöèè ñî ñïåéñåðàìè 12 è 23 ïí, ÷òî ñîîòâåòñòâóåò êîíôèãóðàöèè ñïåéñåðîâ â ëîêóñàõ êàïïà òèïà ìëåêîïèòàþùèõ. Ïî ïåðâè÷íîé ñòðóêòóðå ãåíû òðåòüåãî òèïà òîæå íàèáîëåå áëèçêè ê ãåíàì êàïïà òèïà âûñøèõ ïîçâîíî÷íûõ (ãîìîëîãèÿ ïî àìèíîêèñëîòíîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòè ñîñòàâëÿåò îêîëî 60%).

          Ãåíû ýòèõ òðåõ òèïîâ èìåþò ìåæäó ñîáîé íèçêóþ ñòåïåíü ãîìîëîãèè:40-50% ïî íóêëåîòèäíîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòè Ñ ñåãìåíòîâ è 50-60% ïî ïîñëåäîâàòåëüíîñòè V ñåãìåíòîâ (Hohman et al., 1993).

          Ïîëó÷åííûå äàííûå ïîêàçûâàþò, ÷òî ó õðÿùåâûõ ðûá èìååòñÿ î÷åíü áîëüøîå êîëè÷åñòâî ãåííûõ ñåãìåíòîâ. Îäíàêî ñïåöèôèêà îðãàíèçàöèè ãåíîâ èñêëþ÷àåò êîìáèíàòèâíîå ñî÷åòàíèå ñåãìåíòîâ. Âñå ðàçíîîáðàçèå àíòèòåë ó õðÿùåâûõ ðûá ôîðìèðóåòñÿ òîëüêî çà ñ÷åò ýêñïðåññèè áîëüøîãî êîëè÷åñòâà êëàñòåðîâ.

          Äàííûå î íóêëåîòèäíûõ ïîñëåäîâàòåëüíîñòÿõ èç ðàçíûõ ëîêóñîâ âûÿâèëè íèçêóþ ãåòåðîãåííîñòü ãåíîâ (85-95%), ÷òî óêàçûâàåò íà îòñóòñòâèå ñîìàòè÷åñêîãî ìóòàãåíåçà (Rast et al., 1994).

          Êîñòèñòûå ðûáû.

          Àíàëèç ñûâîðîòî÷íûõ àíòèòåë ïåùåðíîãî ñîìèêà (Ictalurus punctatus) ïîêàçàë íàëè÷èå òðåõ òèïîâ L-öåïåé ñ ðàçëè÷íûìè ìîëåêóëÿðíûìè ìàññàìè: 26, 24 è 22 êÄà. Äâà âèäà àíòèòåë ìûøè, 3F12 è 1G7, çàõâàòûâàþò áîëåå 90% îò îáùåãî êîëè÷åñòâà èììóíîãëîáóëèíîâ â ðåàêöèè èììóíîïðåöèïèòàöèè. Ïðè ýòîì 3F12 àíòèòåëà ñâÿçûâàþòñÿ ñ ìîëåêóëàìè, ñîäåðæàùèìè L-öåïè ìàññîé 24 è 22 êÄà, à 1G3 àíòèòåëà ñ äðóãîé ñóáïîïóëÿöèåé, ñîäåðæàùåé L-öåïè ìàññîé 26 êÄà. Íà îñíîâå ýòèõ äàííûõ L-öåïè ðàçäåëÿþò íà äâà êëàññà, íàçûâàåìûå F è G (Lobb et al.,1984).

          Ãåíîìíàÿ îðãàíèçàöèÿ ëîêóñà L-öåïåé G òèïà èìååò êëàñòåðíûé òèï (ðèñ. 5). Â êàæäîì êëàñòåðå ñîäåðæèòñÿ ïî îäíîìó J è C ñåãìåíòó è äâà V ñåãìåíà. Âàðèàáåëüíûå ãåííûå ñåãìåíòû ðàñïîëîæåíû âñåãäà â ïðîòèâîïîëîæíîé òðàíñêðèïöèîííîé ïîëÿðíîñòè ê J è C ñåãìåíòàì . Â ðÿäå ãåíîìíûõ êëîíîâ îäèí V ñåãìåíò ðàñïîëàãàëñÿ ñ 3' ñòîðîíû îò C ãåííîãî ñåãìåíòà. Ðàçìåð êëàñòåðà ðàâåí ïðèìåðíî 3 òïí, ðàññòîÿíèå ìåæäó êëàñòåðàìè îêîëî 6 òïí (Ghaffari and Lobb, 1993; Bengten, 1994).

          Õîòÿ ãåíû L-öåïåé ñîìèêà èìåþò íèçêóþ ãîìîëîãèþ ñ ãåíàìè äðóãèõ ïîçâîíî÷íûõ (40-50% ïî íóêëåîòèäíîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòè), èõ ìîæíî îòíåñòè ê êàïïà òèïó âûñøèõ ïîçâîíî÷íûõ, òàê êàê ñõîäñòâî ïî ïåðâè÷íîé ñòðóêòóðå ñ ëÿìáäà òèïîì íèæå. Êðîìå òîãî, êîíôèãóðàöèÿ ñïåéñåðîâ èìååò õàðàêòåð êàïïà òèïà: 12 ïí ñïåéñåð àññîöèèðîâàí ñ V, 23 ïí ñïåéñåð ñ J ñåãìåíòîì (Ghaffari and Lobb, 1993).

          Ó ðàäóæíîé ôîðåëè (Oncorhynchus mykiss), ïðåäñòàâèòåëÿ äðóãîãî ñåìåéñòâà êîñòèñòûõ ðûá, òàêæå îáíàðóæåíû äâà òèïà L öåïåé (Daggfeldt et al., 1993). Îäèí èç íèõ (L1) âûñîêîãîìîëîãè÷åí G òèïó ñîìèêà ïî ñòðóêòóðå V è C îáëàñòåé è ñîîòâåòñòâóþùèé ëîêóñ èìååò ñõîäíóþ îðãàíèçàöèþ.

          Ïî-âèäèìîìó, ó ýòèõ âèäîâ îáúåäèíåíèå V è J ñåãìåíòîâ ïðîèñõîäèò òîëüêî çà ñ÷åò èíâåðñèé ñ âîññòàíîâëåíèåì åäèíîé ïîëÿðíîñòè òðàíñêðèïöèè. Ðàçíîîáðàçèå âàðèàáåëüíûõ äîìåíîâ îáðàçóåòñÿ â ðåçóëüòàòå êîìáèíàòèâíîãî ñî÷åòàíèÿ V è J ñåãìåíòîâ â ïðåäåëàõ îäíîãî êëàñòåðà. Íå èñêëþ÷àåòñÿ, ÷òî â ïåðåñòðîéêè ìîãóò âîâëåêàòüñÿ è ñîñåäíèå êëàñòåðû.

          Èíòåðåñíîé îñîáåííîñòüþ êîñòèñòûõ ðûá ÿâëÿåòñÿ î÷åíü âûñîêàÿ ïðîïîðöèÿ ìÐÍÊ, ïðåäñòàâëÿþùåé òàê íàçûâàåìûå ñòåðèëüíûå òðàíñêðèïòû (Ghaffari and Lobb, 1993). Ýòè òðàíñêðèïòû âêëþ÷àþò â ñåáÿ òîëüêî Ñ-ñåãìåíòû è ôëàíêèðóþùèå èõ 5’è 3’-íåòðàíñëèðóåìûå ó÷àñòêè. Êîëè÷åñòâî ñòåðèëüíûõ òðàíñêðèïòîâ ó ñîìèêà è ôîðåëè â 5 ðàç ïðåâûøàåò êîëè÷åñòâî ïîëíûõ VJC-òðàíñêðèïòîâ.

          Ðèñ. 5. Ãåíîìíàÿ îðãàíèçàöèÿ ëîêóñà ãåíîâ L-öåïåé ÈÃ ó ïåùåðíîãî ñîìèêà.

          Ãåííûå ñåãìåíòû îðãàíèçîâàíû â êëàñòåðû. Êàæäûé êëàñòåð ñîäåðæèò äâà VL è ïî îäíîìó JL è CL ñåãìåíòó è èìååò ðàçìåð îêîëî 5 òïí. Ðàññòîÿíèå ìåæäó JL è CL îêîëî 1000 ïí, VL ñåãìåíòû óäàëåíû îò 5' êîíöà JL ñåãìåíòà íà 3 òïí. VL ñåãìåíòû âñåãäà ðàñïîëîæåíû â ïðîòèâîïîëîæíîé òðàíñêðèïöèîííîé ïîëÿðíîñòè ïî îòíîøåíèþ JL è CL ñåãìåíòàì (Ghaffari and Lobb, 1993).

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7