Выделение чистых культур дрожжевых грибов из шишек хмеля

Для отделения сахаромицетов от других дрожжей добавляют 2,5% этилацетата и рН до 4,0 доводят уксусной кислотой. Затем чашки герметизируют. При этих условиях колонии сахаромицетов появляются первыми.

Росту дрожжей на питательных средах при высеве из исходного материала зачастую препятствуют грибы с широко распространяющимися по поверхности субстрата мицелиальными колониями. Они имеют общие с дрожжами потребности в источниках питания, устойчивы к низким значениям рН среды и нечувствительны к действию указанных выше противобактериальных антибиотиков. Для ограничения роста микромицетов в среду добавляют специфические вещества: дифенил (0,005-0,01%), бычью желчь (0,25-0,5%), теллурат калия (0,05-0,15%), пропионат натрия (0,15-0,25%), – или некоторые красители: бром-крезоловый пурпурный (0,0025% или 2,5 мл/л 1% раствора), бенгальский розовый (0,003%), кристаллический фиолетовый (0,001%).( Грин Д.).

Элективные среды. Их применяют для дрожжей из специфических мест обитания.

Осмофильные дрожжи, обитающие в природе в гнездах диких пчел (в меде), обнаруживаемые в производстве сахара и при порче меда или других продуктов с большим содержанием сахара, выделяют на средах с высоким осмотическим давлением: на медовом и осмофильном агарах.

Состав сред: медовый агар: 70% меда в водопроводной воде и 2% агара; синтетический «медовый» агар: 60 г глюкозы, 0,5 г дрожжевого экстракта, 2,5 г агара, 100мл воды; осмофильный агар: б сироп, содержащий 35 массовых частей сахарозы и 10 частей глюкозы, добавляют агар и стерилизуют 20 мин при 112°. Повторное расплавление не рекомендуется.

При выделении осмофильных дрожжей посевы делают на указанные среды и для сравнения – на обычные. Сахар, мед или сиропы растворяют в воде и фильтруют через мембранные фильтры, которые затем помещают для проращивания на агаровые среды. (Жвирблянская А.Ю., Исаева В.С). Почвенные олигонитрофильные дрожжи Lipomyces выделяют на безазотистых средах. Примером такой среды может служить модифицированный агар Эшби (в г 1л дистиллированной воды) : Сахароза − 20,0; K2HPO4 − 0,2; KH2PO4 − 0,1 ; MgSO4·7H2O − 0,2 ; NaCl − 0,2; K2SO4 − 0,1 ; Агар − 20,0.

Для подавления роста бактерий к этой среде добавляют 80 мг/л стрептомицина. Посев производят комочками почвы: навеску в 100 мг распределяют на две чашки Петри, по 50 комочков на каждую. Для равномерного распределения используют трафарет, который подкладывают под чашку. Учет обрастаний производят через 25-30 сут. инкубирования при комнатной температуре. Результат выражают в процентах обрастания комочков почвы молочно-белыми слизистыми колониями липомицетов. (Коновалов С.А.).

Дрожжевые колонии в посевах учитывают следующим образом. Обратную сторону каждой чашки разделяют чернилами на большее или меньшее число частей – от четырех до шестнадцати в зависимости от густоты посева – и просматривают все колонии на каждой площади с объективом 10× в просвечивающем микроскопе или с бинокулярной лупой в отраженном свете. Описывают все встречающиеся типы колоний в стандартных терминах. Из них готовят препараты и микроскопируют при больших увеличениях. Этот детальный просмотр колоний при первом посеве очень важен, так как при последующих пересевах некоторые признаки, например спорообразование, иногда исчезают. Рекомендуется сразу же делать фотографии или зарисовки. Колонии разных типов нумеруют и просчитывают отдельно.( Фениксова Р.В.).

Учет производят дважды. В первый срок отмечают с обратной стороны чашки все выросшие и просчитанные колонии, а за тем оставляют чашки еще на несколько дней для наблюдения за возможным появлением колоний медленно растущих дрожжей.

Отдельные изоляты (штаммы) получают путем пересева из индивидуальных колоний в пробирки на те же среды, на которые производили первичный посев, но без добавления специфических ингибиторов.( Бабьева И.П., Голубев В. И.).

Чистой микробной культурой называют популяцию, представляющую собой потомство одного вида микроорганизма. Каждый новый изолят носит название штамма, которому присваивают буквенное или номерное обозначение.

Расами называют производственные штаммы одного вида дрожжей, различающихся между собой по степени проявления физиологической активности.

В генетических исследованиях пользуются так называемыми клонами – чистыми культурами, полученными от одной споры или гаплоидной клетки. (Бабьева И.П., Голубев В. И.).

Существуют прямые и непрямые методы получения чистых культур дрожжей. Первые основаны на выделении одной клетки или споры под непосредственным контролем через микроскоп. Во втором случае используют косвенные приемы для разделения клеток.

Капельный способ Линдера. Суспензию дрожжей разбавляют жидким суслом до концентрации ≈ 100 клеток в 1 мл и стерильным чертежным пером наносят мельчайшие капельки на необезжиренное покровное стекло, простерилизованное фламбированием в пламени газовой горелки. Капельки располагают в определенном порядке, обычно по пять капель в два ряда, т. е. всего 10 капель на стекле. Затем быстро опрокидывают стекло над влажной камерой, которую запечатывают минеральной смазкой. Все капли немедленно просматривают под микроскопом и отмечают те из них, которые содержат по одной единственной клетке. Если все капли содержат по нескольку клеток, то увеличивают разбавление суспензии и процедуру повторяют. После трех – четырехдневного инкубирования, когда отмеченные единичные клетки образуют микроколонии, последние переносят стерильной иглой или полоской стерильной фильтровальной бумаги в жидкую среду и размножают.( Бабьева И.П., Голубев В. И.).

Метод Линдера в видоизменении Надсона. Чистое покровное стекло проводят трижды через пламя горелки и края его обводят мастикой (смесь равных частей парафина и вазелинового масла). На центральную часть стекла наносят полоску прозрачной среды ч 10% желатины или 0,5 агара. В теплую и еще не застывшую среду вносят иглой суспензию дрожжей такого разведения, чтобы в каплю попало всего несколько клеток. Стекло помещают во влажную камеру и рассматривают препарат при малом увеличении микроскопа. (Булгаков Н.И.).

Находят ориентиры, которыми могут быть частички взвеси, пузырьки воздуха или дефекты стекла, и вычерчивают карту с расположенными по отношению к ориентирам одиночными клетками дрожжей. Через каждые 10-20 ч препарат повторно исследуют, зарисовывая все изменения. Когда отмеченные клетки разрастаются в микроколонии, покровное стекло перевертывают на предметное и под контролем глаза при малом увеличении микроскопа переносят иглой материал в пробирки. ( Булгаков Н.И.).

Метод Линдера, упрощенный Вучковичем. Видоизменение Вучковичем метода Линдера сводится к тому, что капельки суспензии, содержащие 3-4 клетки дрожжей, снимают петлей, которой предварительно захватывают стерильную среду, и переносят штрихом на поверхность плотной среды. Через некоторое время появляются микроколонии, число которых на одном штрихе должно соответствовать количеству исходных клеток в отмеченной капельке.

Из этих колоний пересевом выделяют чистые культуры. Таким способом можно сразу получить несколько одноклеточных культур за короткое время.

Выделение спор дрожжей при помощи микроманипулятора. К использованию микроманипулятора прибегают главным образом при необходимости изолировать споры из асков, так как вегетативные клетки легко повреждаются при микроманипулировании.

Аски разрывают либо механически прикосновением игл микроманипулятора, либо заранее обрабатывая суспензию препаратом ферментов (например, из пищеварительного тракта виноградной улитки Helix pomatia), из лизирующих клеточную стенку дрожжей.

Для работы с микроманипулятором требуются специальные стеклянные микроиглы и влажные камеры. (Палагина Н. К.).

В эту группу включаются методы, основанные на разделении клеток в питательных средах и использовании специфических биологических особенностей отдельных видов для создания преимущественных условий для их роста.

Метод поверхностного посева на агаровые среды. Посевы производят либо из суспензии пипеткой, либо петлей по принципу «истощающего штриха».

Каплю суспензии, содержащей дрожжевые клетки наносят на поверхность застывшей подсохшей среды в чашке Петри. Стерильным стеклянным шпателем равномерно распределяют каплю по поверхности. Этим же шпателем можно еще засеять 2-3 чашки на случай, если в первой будет очень густой рост колоний. Процессы выделения чистой культуры заканчивается пересевом из отдельной, выросшей изолированно колонии в пробирку. Контролем чистоты выделенной культуры служит однородность клеток под микроскопом и однотипность колоний на чашке при последующем рассеве.

Метод рассева на поверхности агаровых сред можно применять как при работе с уже имеющимися культурами при проверке их чистоты, так и при первичном выделении дрожжей из любого субстрата. С целью повышения возможностей избирательного выделения культур дрожжей определенного вида, для рассева используют селективные среды, а при культивировании создают особые температурные условия. (Попова Т.Е., Попова Е.В.).

Для выделения дрожжей родов Brettanomyces и Lipomyces используют их устойчивость к антибиотику актиноиду, добавление которого в среду в концентрации 100-200 мг/л подавляет рост большинства видов других дрожжей.

Выделение чистых культур баллистоспоровых дрожжей. Баллистоспоровые дрожжи легко получить в чистой культуре, используя их способность отбрасывать споры на значительное расстояние. Если после посева на поверхность агаровой среды налить расплавленный агар в крышку чашки Петри и инкубировать ее в перевернутом положении, то через некоторое время на нижней пластинке появятся колонии в результате прорастания отстрелявшихся баллистоспор.

Поддержание и хранение чистых культур дрожжей

Длительное поддержание чистых культур микроорганизмов необходимо как при проведении научно-исследовательских работ, так и в производстве и при хранении в коллекциях.

Из-за различий биологических свойств видов невозможно использовать с равноценными положительными результатами один общий способ хранения для разных культур дрожжей. Большой опыт по хранению культур микроорганизмов, в том числе и дрожжей, накоплен сотрудниками крупных национальных коллекций, в которых имеется возможность проверять и оценивать разные методы хранения применительно к широкому набору дрожжевых организмов.

Наиболее широко применяемый способ – это поддержание культур путем их периодических пересевов. В последние два десятилетия получили распространение также методы хранения микробных культур под минеральным маслом и лиофильная сушка. Так как эти три метода применяются уже много лет, то имеется возможность сравнительной оценки их пригодности для хранения разных видов дрожжей. Другие, менее широко используемые или недавно разработанные методы можно рекомендовать лишь для проверки с обязательным дублированием культур, которые поддерживаются обычными способами. (Семихатова Н. М., Белова М. Ф., Лозенко Л. Д.).

Периодические пересевы

Обычно культуры поддерживают, пересевая их на агаровых средах в двойной повторности. Одна пробирка, которую после засева совсем не открывают, служит контрольной, а из второй по мере надобности делают отсевы.

Частота пересевов. Сроки пересевов определяют для большинства культур дрожжей скоростью высыхания среды. Она зависит от температуры и влажности помещения, где хранят пробирки. В голландской коллекции*, насчитывающей более 6000 штаммов дрожжей, культуры хранят в специально предназначенных для этих целей, в постоянно проветриваемой комнате, где температура поддерживается зимой 18°С, а летом 20°С. Частота пересевов при этих условиях – каждые 5-7мес или пять раз в два года для основной массы культур и более частые для немногих других: например, ежемесячные для Schizosaccharomices japonicas и каждые две недели для Cyniclomyces (=Saccharomycopsis) guttulata.

Промежутки между пересевами можно увеличить за счет более плотного закупоривания пробирок и снижения температуры хранения. Так использование пробирок с завинчивающимися металлическими крышками вместо обычных ватных пробок предохраняет от высушивания, но хуже обеспечивает чистоту сохраняемых культур. Применение вазелинового масла для снижения скорости высыхания культур так же имеет свои недостатки. Поэтому хорошо сделанные ватные пробки(их можно сверху заливать парафином) все же остается лучшим средством закрывания пробирок. Они обеспечивают достаточный газообмен, хорошо предохраняют от микробного загрязнения и легко изготавливаются при помощи специальных машин, которые просты и доступны для любой лаборатории. .( Бабьева И.П., Голубев В. И.).

Ватные пробки, однако, не предохраняют культуры от заражения их микофильными клещами (mites). Для профилактики используют следующий прием. Перед посевами или пересевами культур пробку слегка выдвигают из пробирки и наносят на нее каплю раствора содержащего 10г сулемы, 50мл глицерина, 500мл этилового спирта и 450 мл воды. Затем пробку вдвигают в пробирку и несколько раз проворачивают ее, чтобы смочить внутренние стенки пробирки. В раствор можно добавить какой-либо краситель, для контроля за равномерностью смачивания.

Температура. Если хранение ведется при температуре в пределах 15-20°С , то после пересева пробирки сразу же помещают в коллекционное помещение, за исключением тех культур, которые требуют для роста более высокой температуры. К последним относятся, например, такие виды, как Saccaharomyces castellii и Torulopsis lacctis-condensii которые инкубируют при 30°С, а Candida slooffii, Pityrosporum ovale, P. Pachydermatis, Torulopsis bovina, T. Pintolopesii и Saccharomyces telluris – при 37°С психрофильные дрожжи выращивают и хранят при 3-4°С в холодильнике. Это виды: Candida aquatic, C. curiosa, C. salmonicola и все представители рода Leucosporidium. При низкой температуре после появления хорошего роста можно хранить и все другие дрожжи, за исключением психрофобных видов, ассоциированных с теплокровными животными, и некоторых устойчивых к полиеновым антибиотикам мутантов.

Среды. Во многих лабораториях и коллекциях дрожжи поддерживают и хранят на сусло-агаре. Было показано, однако, что на этой сложной среде при длительном хранении происходит изменение физиологических свойств, характерных для вида, за счет адаптации или стабилизации мутантов. В связи с этим для хранения более пригодна среда следующего состава, (в %):

Глюкоза 4 дрожжевая вода

Пептон 0,5 рН 5,8-6,0

Дрожжевую воду готовят, автоклавируя при 121°С 15 мин суспензию дрожжей (200 г на 1 л водопроводной воды) с небольшим количеством яичного белка. После стерилизации еще горячую воду дважды фильтруют через бумажный фильтр. .( Бабьева И.П., Голубев В. И.).

Пивоваренные дрожжи лучше поддерживать на сусло-агаре или на среде следующего состава (в %): Сусло − 3; Дрожжевой экстракт − 3; Пептон 5; Глюкоза − 1; Агар − 2.

Лучше растут на сусле, чем на глюкозо-пептонной среде, базидомицетовые дрожжи, близкие к головневым грибам.

Липомицеты поддерживают на среде с солодовым и дрожжевыми экстрактами, на которой эти дрожжи лучше сохраняют спорообразующую способность(в г/л.): Глюкоза − 10; Пептон – 5; Сусловый агар – 3; Дрожжевой экстракт – 3 Агар – 20; Водопроводная вода, л – 1.

В некоторых коллекциях дрожжи поддерживают в жидких средах (сусло с дрожжевым автолизатом, пептоном и глюкозой) с пересевами через 4 мес.

Осмотолерантные дрожжи, например Saccaromyces (= Zygosaccaharomyces) rouxii, пересевают на среде с высоким осмотическим давлением, а именно: на сусло-агаре с 50% глюкозы.

Дрожжи родов Brettanomyces и Dekkera сильно подкисляют среду в процессе роста и быстро гибнут, поэтому для их культивирования добавляют в среду 2% СаСО3 и делают пересевы через каждые 2 мес.

Существуют также другие способы хранения чистых культур дрожжевых микроорганизмов.

Хранение под минеральным маслом заливка агаровых культур минеральным маслом с целью задержать высыхание и тем самым увеличить сроки пересевов.

Лиофилизация − процесс высушивания под вакуумом из замороженного состояния.

Методы криогенного хранения − замораживание дрожжей производят при разных режимах, включая температуры от − 10 до − 196°С и различные скорости охлаждения.

Хранение на адсорбентах − в качестве адсорбентов используют почву, песок, коалин, селикагель, вату и фильтровальную бумагу. Этот способ хранения не имеет разработанной стандартной техники.( Семихатова Н. М., Малыгина М. В., Володина Т. И.).

2 Глава Собственные исследования

Схема 1 направления исследования

Сбор хмеля и подготовка его к исследованию

↓

Сушка хмеля

↓

Приготовление смыва

↓

Первичный посев

↓

Инкубирование

↓

Микроскопирование колоний

↓

Получение ЧКД

↓

Идентификация полученных культур

2.1 Материалы и методы исследований

Работа проводилась на кафедре биологической и химической технологии Горского ГАУ, т. к. материально – техническая база позволила провести все необходимые исследования. Материалом для проведения исследований явились: дикий хмель и выделенные из него дрожжи.

Работа включала следующие этапы:

·          выделение штаммов дрожжей;

·          определение видовой принадлежности выделенных дрожжей.

·          экономические расчеты.

Приборы и оборудование

В ходе исследований использовали :

·          Автоклав;

·          Термостат;

·          Холодильник;

·          Шкаф сушильный;

·          Настольный бокс;

·          Микроскоп;

·          Весы ( настольные и аналитические );

·          Различную химическую посуду;

·          Питательные среды и реактивы.

Методы исследований

Поверхность твердого тела исследуют путем получения смыва, отпечатка или соскоба

Смыв производят стерильной водой непосредственно с объекта, помещая его в сосуд или же при больших размерах объекта пользуясь ватными или марлевыми тампонами. Такие тампоны затем опускают в суспензионную жидкость, встряхивают и делают высев. Метод смыва с поверхностей применяют при исследовании таких объектов, как плоды и овощи, зерно и сметана, мясо и шкуры и тому подобное, а также с оборудования. Высев на плотные питательные среды из подготовленной суспензии делают пипеткой, внося в каждую чашку по 0,5 мл или по одной капле измеренного объема. Чашек берут всегда не менее трех для каждого разведения, чтобы получить среднее число колоний на одной чашке После посева чашки инкубируют 24 ч в обычном положении, чтобы агар адсорбировал жидкость, а за тем перевертывают во избежание попадания на поверхность капель конденсата с крышки Подбор температурных условий при выделении дрожжей зависит от источника выделения и целей исследования

Определения проводили по следующим ГОСТам :

·     сухое вещество – высушиванием в сушильном шкафу при температуре 60°С;

·     гигроскопическая влажность – высушиванием в сушильном шкафу при температуре 100 – 105° С, ГОСТ 1396.3 – 92 (27548 - 97);

·     «сырой» жир – в аппарате Сокслета, ГОСТ 13496.65;

·     «сырой» протеин – по методу Къельдаля, ГОСТ 1396.4 (28074 – 89);

·     «сырая» зола – методом сухого озоления (температура 400 – 4500С), ГОСТ 26226 – 95;

·                   БЭВ – расчетным методом.

2.2 Подготовка питательной среды

Среды для дрожжей и грибов

Для выращивания дрожжей, при выполнении эксперимента мы использовали следующие виды питательных сред.

Среда Сабуро. Основой этой среды является дрожжевая вода. На 1 л водопроводной (недистиллированной) воды берут 80 г прессованных пекарских дрожжей (или 20 г сухих дрожжей), кипятят 15 мин, фильтруют через бумажный фильтр, разливают по флаконам и стерилизуют при 1 атм 20 мин. К 100 мл стерильной дрожжевой воды добавляют 1% пептона, 2% агара,

нагревают до растворения агара, затем добавляют 4% глюкозы (или мальтозы), фильтруют, разливают в пробирки и стерилизуют при 0,5 атм 20 мин. После стерилизации среду в пробирках скашивают. Выращивание длится 48 ч при 22°С. Среду можно готовить и не на дрожжах, а из-обычной 1% пептонной воде.

Жидкая среда Сабуро отличается от описанной выше тем, что не содержит агар-агара. Среду разливают в колбы по 150—200 мл, стерилизуют так же, как описано выше. Эта среда употребляется главным образом для получения гомокультуры.

Пивное сусло-агар. Неохмеленное пивное сусло — хорошая среда для некоторых молочнокислых и уксуснокислых бактерий, дрожжей, плесневых грибов и других представителей гетеротрофных микроорганизмов, использующих сахара в качестве источника углерода и энергетического материала. В сусле содержатся аминокислоты, элементы нуклеиновых кислот, витамины (в основном группы В), безазотистые органические кислоты, минеральные соли, большое количество углеводов (до 20%, из которых 80% составляет мальтоза), т. е. все, что необходимо для развития наиболее требовательных сапрофитных микроорганизмов.

Сусло готовят следующим образом. 250 г размолотого солода заливают 1 л водопроводной воды, нагревают до 48—50° и поддерживают эту температуру в течение получаса, непрерывно помешивая смесь, чтобы избежать образования комков. В последующие полчаса температуру поднимают до 55— 58°С и поддерживают ее на этом уровне до полного осахаривания крахмала, т.е: до тех пор, пока реакция остывшей смеси с йодом будет отрицательной. При указанном режиме происходит также гидролиз белков до аминокислот и полипептидов. Экстракт отфильтровывают через вату или бумажный фильтр. В фильтрате определяют концентрацию Сахаров, пользуясь ареометром Баллинга, градусы (°Б) которого примерно соответствуют процентному содержанию сахара в растворе.

Неохмеленное пивное сусло разводят водопроводной водой до содержания сахара 7—8° по Баллингу (измеряют сахарометром) и стерилизуют в бутылях при 110°С 10 мин. В таком виде сусло может сохраняться длительное время. Перед употреблением над осадочную жидкость осторожно сливают с осадка. В 1 л стерильного сусла добавляют 18 г агар-агара, нагревают до растворения агара и разливают среду в стерильные пробирки, стерилизуют при 110°С 10 мин. Жидкое сусло после сливания отстоявшейся жидкости с осадка разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при режиме, указанном для сусло-агара.

Рисовая среда Левиной. 20 г риса в зернах измельчают в ступке и заливают 500 мл дистиллированной воды, стерилизуют текучим паром 45 мин. Укрывают тепло и оставляет для отстаивания, затем фильтруют через 4 слоя марли. Осадок не отжимают. 20 г агар-агара расплавляют на открытом огне или текучим паром в 500 мл дистиллированной воды, фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Фильтрат агара смешивают с фильтратом риса и добавляют дистиллированной воды до 1 л. Стерилизуют при 1 атм (120°С) 20 30 мин. Разливают в чашки Петри, на которые производят прямой посев материала. Чашки с посевом, плотно завертывают в 2 слоя бумаги и помещают при комнатной температуре или при 30°С на 18 ч. Результаты посева рассматривают под малым увеличением микроскопа непосредственно на чашке. Отмечают филаментацию, тип микроколоний (паукообразный, звездчатый, круглый и др.).

Стерилизация питательных сред.

Стерилизация является заключительной операцией при приготовлении любой питательной среды. Питательные среды после разливки их в сосуды чаще стерилизуют нагреванием — термостерилизацией. Перед стерилизацией сосуды (колбы, пробирки) с налитыми в них средами закрывают ватными пробкам предохраняющими их в дальнейшем от заражения микробами из вне.

Стерилизация насыщенным паром под давлением. Такую стерилизацию проводят в автоклаве. Автоклав представляет собой двухстенный металлически котел, герметично закрывающийся крышкой. Между стенками котла находится вода. Стерилизуемые объекты ставят на дно автоклава. Автоклав снабжен манометром указывающим давление пара в котле, выпускным краном для выхода воздуха и пара и предохранительным клапаном, обеспечивающим выход пара при превышении заданного давления.

Автоклав обогревается газом или электричеством. Образующийся при кипении воды пар поступает в котел через отверстия, имеющиеся в верхней части его внутренней стенки, и через выпускной края выходит, вытесняя из автоклава воздух. После полного вытеснения воздуха (при этом выделяется сильная сплошная струя пара) выпускной кран закрывают и в автоклаве постепенно повышается давление. Когда оно достигнет 1 атм (по манометру), подогрев регулируют, чтобы поддерживать давление на одном уровне в течение необходимого времени. При таком давлении водяной пар имеет температуру 120° С.

При этой температуре выдерживают питательные среды (если объем их не более 0,5—1 л) в течение 20—30 мин. При таком режиме стерилизации погибают не только вегетативные клетки микроорганизмов, споры плесеней и дрожжей, но и бактериальные споры. По окончании стерилизации выключают источник нагрева, после того как стрелка манометра снизится до нуля, осторожно открывают выпускной кран, чтобы вытеснить из автоклава пар. Крышку автоклава открывают лишь после того, как он охладится.

Стерилизуют в автоклаве воду, мясо-пептонный бульон, дрожжевой автолизат, агаровые и другие среды, которые не претерпевают заметных изменений при темпетуре 120° С.

Стерилизация текучим паром. Эта стерилизация бывает дробной, или последовательной. Она применяется чаще для питательных сред, которые могут заметно изменять свои свойства при стерилизации в автоклаве, например молоко, среды, содержащие сахара, желатин.

Для стерилизации используется аппарат Коха (кипятильник Коха). Он представляет собой металлический цилиндр, покрытый изоляционным материалом, с двойным дном и неплотно закрывающейся крышкой, снабженной термометром. На дно цилиндра наливается вода. Над водой располагается металлическая подставка с отверстиями для прохождения пара, на которую помещают стерилизуемые питательные среды.

Вода в аппарате нагревается газом или электричеством до 100°С. Образующийся пар (текучий), прогревает стерилизуемые материалы, выходит через специальное отверстие и неплотности крышки.

Стерилизация производится дробно — в три приема три дня подряд по 30 мин ежедневно. Повторная стерилизация, вызывается тем, что при температуре 100° гибнут не все споры бактерий. В промежутках между нагревами (каждый — раз в сутки) питательная среда выдерживается в термостате при 25° С. За это время оставшиеся живыми споры прорастают в вегетативные клетки, которые и уничтожаются последующим нагревом при 100° С.

Холодная стерилизация (фильтрация). Метод холодной стерилизации применяется для жидких сред, которые не выдерживают нагревания.

Способ заключается в фильтровании сред через специальные мелкопористые бактериологические фильтры, задерживающие микроорганизмы (ультромикробы проходят).

Фильтры изготовляются из различных материалов из фарфоровой глины, асбеста, нитроклетчатки (мембранные ультрафильтры) и др.

2.3 Выделение дрожжей

Смыв производили непосредственно с шишек хмеля, помещая его в сосуд с водой, встряхивая в колбе с водой 10 мин в качалке, а затем делают высев, образец серийно разводят, чтобы сделать высев сразу на чашке Петри. В качестве суспензионных жидкостей использовали стерильную водопроводную воду, в которую добавляют NаCI (5г на 100мл). Посев «истощающим штрихом» производят петлей: либо, нанося очень густые штрихи, либо прожигая петлю после каждого штриха. (См. рис.). Разные способы посева «истощающим штрихом» для получения отдельных колоний 1, 2, 3, 4, 5, 6 – последовательность нанесения штрихов. На двух последних чашках петлю после каждого штриха прожигают.

Высев производили на плотные питательные среды, внося в каждую чашку по 0,5мл смыва с шишек хмеля. После посева чашки Петри помещали в термостат в течении 24 ч в обычном положении, чтобы агар адсорбировал жидкость, а затем чашки переворачивали, во избежание попадания на поверхность капель конденсата с крышки. Инкубированние проводили при t 37 °С – 48 часов.

Дрожжевые колонии в посевах учитывали следующим образом. Обратную сторону каждой чашки разделяли на 4 части и просматривали все колонии на каждой площади с объективом 10Х количественный учёт численности дрожжей и в единице массы или объёма вычисляли по формуле:

n=абв

а – среднее число колоний в одной чашки Петри;

б – число капель в 1 мл суспензии;

в – степень разбавления образца.

Отдельные изоляты (штаммы) получали путем пересева из индивидуальных колоний в пробирки на те же питательные среды, на которые производили первичный высев.

Перед определением каждую культуру проверяли на чистоту путём микроскопирования и рассева на плотные питательные среды. Из каждой исходной культуры готовили пересевом в пробирку с сусло–агаром контрольную культуру и сохраняли её весь период, по определению не открывая её. Форму описывали и определяли в культурах разного возраста на плотных и жидких средах. Первый просмотр 2–3 сутки культивирования при 25–28 °С, затем культуру оставили при комнатной температуре и описывали. Клетки измеряли микрометром длину и ширину не менее чем у 20 клеток и указывали крайние значения. Измерение производили для культур выращенных на жидких средах. Второй просмотр 1–2 недели при 17–18 °С.

Культуральные свойства полученных колоний Таблица 1

Вегетативное размножение наблюдали на твёрдых средах в культурах 2–3 суточного возраста.

Культуральные признаки микроорганизмов, при росте на плотных средах описывали по штриху.

Отмечали: цвет, консистенцию, структуру поверхности, форму края или границы роста. Для получения стандартного штриха использовали питательную среду сусло-агар с концентрацией СВ 10%

Рост описывали через 6–8 суток при культивировании при 25 °С, первое описание через 6 недель второе описание.

Рост дрожжей в жидких средах наблюдали при использовании солодового сусла Пивное сусло-агар концентрации СВ 12 % или глюкозо–пептонной среды с дрожжевым экстрактом. Посев производили в пробирки на скошенную питательную среду, и инкубировали 7 дней, при комнатной t (17–18 °C).

В ходе проведённых опытов, приведённых в таблице было выделено 14 штаммов бактерий из которых 5 штаммов дрожжей , и 2 штамма кокков , из которых для дальнейших исследований были использованы штаммы дрожжевых микроорганизмов № 2 которые максимально соответствует нашим требованиям.

Пересевы производили в стерильную плотную питательную среду до получения однородных колоний. После каждого пересева содержимое чашек Петри проверяли на чистоту.

2.4 Определение видовой принадлежности

Чистой культурой считается выращенная масса клеток, состоящая из дрожжей, которые принадлежат одному виду и получены как потомство одной клетки.

Дрожжи в виде чистых культур широко используются в технологии производства многих пищевых продуктов (кисломолочные, сыры, хлеб, вино, пиво и др.). Применение культур дрожжей с известными свойствами дает возможность эффективнее использовать их деятельность — экономичнее перерабатывать сырье, получать высокий выход и надлежащее качество продукции.

Идентификация — определение систематического положения микроорганизмов, выделенных в чистые культуры. Для установления семейства, рода, вида, к которому принадлежат выделенные в чистые культуры дрожжей, необходимо изучить их морфологические, культуральные и физиологические признаки.

Морфологические признаки изучаются под микроскопом в препаратах живых и мертвых микроорганизмов.

Культуральные признаки устанавливаются по характеру роста культуры изучаемого микроорганизма на плотных и жидких питательных средах.

Физиологические признаки, обусловленные наличием ферментов в клетках, устанавливаются при посеве в специальные среды, в состав которых входят те вещества, воздействие на которые выявляется у изучаемого микроба.

Каждый новый штамм микроорганизмов должен быть охарактеризован для получения полных данных о свойствах чистой культуры данного микроорганизма.

Результатом идентификации обычно является отождествление выделенного микроорганизма с каким-нибудь видом или отнесение его к определённому роду.

Полученные данные используют для составления паспорта промышленных штаммов, а так же для их идентификации.

Проведя исследования важнейших морфологических, физиологических и культуральных признаков, устанавливают видовое название микроорганизма по определителю («ключу»). Для каждой группы микроорганизмов (бактерии, дрожжи, грибы) существуют свои определители, составленные с учетом специфических особенностей данной группы.

При описании колоний, выросших на поверхности среды отмечают:

- форму, профиль и цвет- невооружённым глазом;

- край- при малом увеличении микроскопа (объектив 8*);

- консистенцию - прикосновение петли к колонии;

- величину – линейкой ( колонии точечные – менее 1мм в диаметре, мелкие – 1-2 мм, крупные – 3-4 мм и более).

Морфологические свойства изучаемых штаммов микроорганизмов. n=5

Таблица 2.

В результате полученных данных установлено, что размер дрожжевых клеток 6 мкм.

На плотных питательных средах изучают характер колоний. Поскольку колония образуется в результате размножения клеток, её строение зависит от особенностей размножения микробов данного вида и, следовательно, каждому виду присущи характерные признаки.

Культуральные свойства исследуемых штаммов дрожжей n=5

Таблица 3

Физиолого-биохимические свойства изучаемых штаммов

В связи с тем, что 5 исследуемых штаммов по культуральным свойствам были идентичными, для дальнейшего изучения взяли один из них штамм №5. Для определения вида была проведена идентификация по приложению №2.6

Физиолого-биохимические свойства изучаемого штамма Таблица 4

У выделенных штаммов микроорганизмов, рост наблюдается при температуре от 19 − 36 ºС. Оптимальной для культивирования штамма является температура от 30 − 35°С. При культивировании на рисовой среде Левиной, испытуемого штамма дрожжей наблюдается спорообразование. Образование СО2 из глюкозы наблюдается в аэробных условиях. Выделенный штамм сбраживает следующие углеводы: мальтоза, сахароза, лактоза, декстрин; галактоза, раффиноза − частично.

Культуральные свойства Saccharomyces

Клетки круглые и овальные, иногда удлиненные. Вегетативное размножение многосторонним почкованием. Может быть примитивный псевдомицелий, истинного мицелия нет. Колонии обычно пастообразные. На жидких средах при продолжительном культивировании может образовываться пленка, но она не бывает сухой порошковидной или всползающей. Аски образуются преимущественно из вегетативных диплоидных клеток без непосредственно предшествующей конъюгации. При созревании спор сумки не вскрываются. Аскоспоры круглые или слабоовальные, бесцветные, гладкие, 1 — 4 в аске. Все виды активно сбраживают сахара и не используют нитраты. Лактозу и высшие парафины не ассимилируют. Дрожжи этого рода с давних времен распространены в кустарном виноделии и широко используются в разных отраслях бродильной промышленности, в связи с чем они более всех других дрожжей изучены в разных аспектах. Их систематика, однако, постоянно пересматривается. Центральный вид — Saccharomyces cerevisiae Hansen известен в десятках синонимов, которые в настоящее время рассматриваются как производственные расы, но не самостоятельные виды.

В разных определителях объем рода Saccharomyces сильно варьирует. Ван дер Вальт в определителе Лоддер [55] различает 41 вид, среди которых есть диплоидные, гаплоидные и виды с соматогамной автогамией. В. И. Кудрявцев [11] включает в род Saccharomyces только диплоидные дрожжи, выделяя гаплоидные виды в Zygosaccharomyces, а виды с автогамным половым процессом — в род Debaryomyces. В результате полученных данных, при изучении физиологических свойств штамма, установлено, что данный штамм относится к дрожжам и предварительно идентифицирован как Saccharomyces сеrеvisiае. (рис.3.в приложении № 2.)

Основные показатели процесса культивирования дрожжей

Для определения химического состава дрожжей, нам было необходимо накопить определенное количество биомассы. С этой целью мы использовали ферментер БИОЛУК-3Ш, аппарат для непрерывного культивирования микроорганизмов. Установка может использоваться при процессах переработки субстратов сложного химического состава, для интенсификации микробиологических процессов, а также для ускоренного автоматического отбора активных штаммов, перспективных при использовании в различных областях народного хозяйства и промышленности. Установка-БИОЛУК-3Ш может использоваться при исследованиях в генетике, биохимии, микробиологии, физиологии и экологии.

Технологические характеристики установки БИОЛУК-3Ш

Установка может работать с ферментерами объемом 0,1-10 л

Объем культуры в ферментерах 0,05-7 л

Скорость вращения мешалки до 1500 об/мин

Аэрация 0-2,76 л/мин

Производительность дозатора 20-400 мл/час

Автоматическая стабилизация рН от 2 до 12

Потребляемая мощность 600 Вт

Напряжение питания 220 В, 50 Гц

Вес 25 кг

Принцип действия установки БИОЛУК-3Ш

Установка работает следующим образом. Питательная среда при помощи перистальтического насоса дозатора по силиконовому шлангу подается в ферментер. Скорость подачи среды в ферментер регулируется в зависимости от цели и задачи исследования, то есть в режиме рН-стата, хемостата. Воздух ферментер поступает от микрокомпрессора через ротаметр, показывающий расход воздуха, воздушный и водяной фильтр, служащий для стерилизации и увлажнения подаваемого воздуха для насыщения кислородом культуральной жидкости. Перемешивание культуральной жидкости осуществляется вращением мешалки на основе электродвигателя. Регистрация и управление параметров растущей культуры происходит с помощью датчиков рН, еН, рО2 и др. Выбор датчиков определяется задачей исследования для стабилизации температуры в ферментере предусмотрено устройство, соединенное с термостатом, для поддержания заданной температуры. Излишки культуральной жидкости из ферментера уносятся воздухом через сливную трубку в бак для урожая.

Подъемная сила и бродильная энергия таких дрожжей понижается, в процессе выращивания наблюдается отмирание части дрожжевых клеток. Количество мертвых клеток составляет около 7 %. В связи с этим на протяжении всего процесса культивирования нами поддерживалось температура 28 – 300 С.

Основные показатели процесса культивирования дрожжей. Таблица 5

Во время культивирования дрожжей нами каждый час определялись следующие показатели: температура, прирост биомассы и количество дрожжевых клеток в мл.

Дрожжевые клетки, как и все микроорганизмы, при культивировании развиваются по четырем фазам роста: лагфаза, фаза логарифмического роста, стационарная фаза и фаза отмирания. Однако наша работа предусматривает только первые три фазы.

Лагфаза – это период, во время которого внесенные в питательную среду дрожжевые клетки адаптируются к окружающей среде.

Фаза логарифмического роста характеризуется высокой активностью размножения клеток. Количество почкующихся клеток быстро увеличивается, достигая 70 – 80%. Биомасса дрожжей увеличивается вследствие образования новых дочерних клеток, которые, вырастая до размеров материнской клетки, начинают почковаться, образуя новую генерацию. После отпочковывания молодой клетки материнские клетки вновь начинают почковаться, т.е. в этой фазе наблюдается максимальная скорость роста дрожжевых микроорганизмов.

В стационарной фазе образование новых клеток практически прекращается, заканчивается также и почкование, так как питательные вещества в дрожжерастительный аппарат не поступают. Для поддержания жизнедеятельности клетки используют оставшиеся питательные вещества. Увеличивается масса и размер клеток. Эта фаза соответствует их дозреванию.

Фаза отмирания характеризуется отсутствием роста и размножения микроорганизмов. Масса клеток уменьшается, наблюдается автолиз. Качество клеток резко ухудшается.

Содержание питательных веществ в биомассе дрожжей, n=5

В полученных нами дрожжах были определены следующие показатели:

·          сухое вещество – высушиванием в сушильном шкафу при температуре 60°С;

·          гигроскопическая влажность – высушиванием в сушильном шкафу при температуре 100 – 105° С, ГОСТ 1396.3 – 92 (27548 - 97);

·          «сырой» жир – в аппарате Сокслета, ГОСТ 13496.65;

·          «сырой» протеин – по методу Къельдаля, ГОСТ 1396.4 (28074 – 89);

·          «сырая» зола – методом сухого озоления (температура 400 – 4500С), ГОСТ 26226 – 95;

·          БЭВ – расчетным методом.

В полученных нами дрожжах были определены показатели, которые представлены в таблице 6.

Химический состав дрожжей Таблица 6

Содержание сухого вещества составило 28,1 %, влаги около 80%, протеина 41,4%, жира 1,8%, золы 8,8%. Содержание БЭВ (Безазотистых Экстрактивных Веществ) составило 48%.

Из анализа выше приведенных данных следует, что исследуемые штаммы дрожжей можно отнести к роду Saccharomyces виду сеrеvisiае.

2.5 Обсуждение результатов

1. Вегетативное размножение наблюдали на твёрдых средах в культурах 2–3 суточного возраста, культуральные признаки, описывали по штриху. Отметили: круглую форму колоний, выпуклый профиль, гладкие края и однородную структуру. Цвет колоний – белый.

2. В ходе проведённых опытов, было выделено 5 штаммов дрожжей, из которых для дальнейших исследований были использованы штаммы дрожжевых микроорганизмов, которые максимально соответствует нашим требованиям, по фенотипическим признакам.

3. Пересевы производили в стерильную плотную питательную среду до получения однородных колоний. После каждого пересева содержимое чашек Петри проверяли на чистоту культуры.

4. На плотных питательных средах изучают характер колоний. Поскольку колония образуется в результате размножения клеток, её строение зависит от особенностей размножения микробов данного вида и, следовательно, каждому виду присущи характерные признаки. В результате размеры клеток 6 ± 0,4мкм, отметили также наличие спорообразования и почкования. Клетки не подвижны.

5. У выделенных штаммов микроорганизмов, рост наблюдается при температуре от 19 − 36 ºС. Оптимальной для культивирования штамма является температура от 30 − 35°С. В процессе культивирования была получена биомасса дрожжей (88,98 г/л.)

7. Выделенный штамм сбраживает углеводы. Наблюдается спорообразование, при культивировании на рисовой среде Левиной. Образование СО2 из глюкозы − в аэробных и анаэробных условиях.

6.Содержание сухого вещества составило 28,1 %, влаги около 80%, протеина 41,4%, жира 1,8%, золы 8,8%. Содержание БЭВ (Безазотистых Экстрактивных Веществ) составило 48%. В результате полученных данных, установлено, что данный штамм относится к дрожжам и предварительно идентифицирован как Saccharomyces сеrеvisiае.

Глава 3 Экономическая эффективность

Одно из важнейших направлений повышения эффективности производства в пищевой промышленности – снижение материалоемкости. Пивоваренная промышленность относится к числу наиболее материалоемких отраслей. Удельный вес материальных затрат в издержках производства в пивоваренной промышленности достигает 80%. Эффективное использование материальных ресурсов в пивоварении означает снижение себестоимости продукции и более эффективное использование сельскохозяйственного сырья.

Материалоемкость производства определяется величиной материальных затрат, приходящихся на 1 руб. товарной продукции.

Основным элементом материальных затрат являются затраты на зерновое сырье. На величину затрат зернового сырья в стоимостном выражении существенное влияние оказывают закупочные цены на ячмень, удельный вес товарного солода, состав закупаемого зерна по классам.

В экономическом смысле себестоимость — это денежное выражение затрат предприятия на производство и реализацию продукции. Количественно она не совпадает с той частью стоимости, которую отражает, поскольку потребленные в процессе производства орудия (машины, оборудование и т. д.) и предметы труда (питательные среды), включаются в себестоимость продукции не по общественно необходимым затратам, а по действующим ценам которые, как правило, не совпадают со стоимостью.

Основу себестоимости продукции, (работ, услуг) составляют затраты прошлого и живого труда. Прошлый труд заключен в средствах производства, которые оцениваются по фактическим ценам приобретения, а материалы собственного производства (агар, пептон и т. д.) — по себестоимости. Живой труд учитывается в размере его фактической оплаты, включая и часть затрат по воспроизводству рабочей силы.

Себестоимость продукции (работ, услуг) представляет собой стоимостную оценку используемых в процессе их производства природных ресурсов, сырья, материалов, топлива, энергии, основных фондов, трудовых ресурсов, а также других затрат на ее производство и реализацию. Таким образом, она отражает величину таких затрат, которые обеспечивают процесс простого воспроизводства на предприятии; это форма возмещения потребляемых факторов производства.

Основным направлением повышения эффективности производства в пищевой промышленности является более полное использование производственных мощностей и основных фондов предприятия, а также рост производительности труда и улучшения качества продукции. (Опарин Н.Г., 2003).

Валовая продукция - это стоимость всей произведенной, продукции и выполненных работ, включая незавершенное производство. Выражается в сопоставимых и действующих ценах.

Товарная продукция отличается от валовой тем, что в нее не включают остатки незавершенного производства и внутрихозяйственный оборот. По своему составу на многих предприятиях валовая продукция совпадает с товарной, если нет внутрихозяйственного оборота и незавершенного производства.

Расчет себестоимости и производства.

Сырье и основные материалы. Стоимость сырья и основных материалов для производства продукции представлена в таблице.

Таблица 7 Стоимость сырья и основных материалов, используемых при производстве 100г. дрожжей

Остальные составляющие затрат сводятся в следующих таблицах.

1. Вспомогательные материалы.

С учетом промышленных выработок установлены затраты по статье по данной статье в размере 1,1% стоимости затрат по статье «Сырье и основные материалы».

(1215,9 : 100) * 1,1= 13,374 руб.

2. Транспортно-заготовительные расходы

На основании анализа затрат при производстве дрожжей установлены затраты по статье в размере 2% стоимости затрат на закупку сырья и материалов.

1215,9* 0,02=24,318 руб.

Таблица 8 Стоимость топлива и энергии, используемые при производстве продукта

4 Глава Экологическая безопасность

Экология является теоретической основой рационального природоиспользования, ей принадлежит ведущая роль в разработке стратегии взаимоотношений природы и человеческого общества. Промышленная экология рассматривает нарушение природного равновесия в результате хозяйственной деятельности. При этом наиболее значительным по своим последствиям является загрязнение окружающей среды. Под термином «окружающая среда» принято понимать все то, что прямо или косвенно воздействует на жизнь и деятельность человека.

По-новому следует оценивать и роль дрожжей в природных экосистемах. Например, считавшиеся долго безвредными комменсалами многие эпифитные дрожжи, обильно обсеменяющие зеленые части растений, могут оказаться не такими уж «невинными», если учесть, что они представляют собой лишь гаплоидную стадию в жизненном цикле организмов, близко родственных фитопатогенным головневым или ржавчинным грибам. И, наоборот, патогенные для человека дрожжи, вызывающие опасные и трудноизлечимые болезни - кандидоз и криптококкоз - в природе имеют сапротрофную стадию и легко выделяются из мертвых органических субстратов. Из этих примеров видно, что для понимания экологических функций дрожжей необходимо изучение полных жизненных циклов каждого вида. Обнаружены и автохтонные почвенные дрожжи с особыми функциями, важными для образования почвенной структуры. Неисчерпаемы по многообразию и связи дрожжей с животными, особенно с беспозвоночными.

Загрязнение атмосферы может быть связано с естественными процессами: извержением вулканов, пыльными бурями, лесными пожарами.

Кроме того, атмосфера загрязняется в результате производственной деятельности человека.

Источниками загрязнения воздуха является дымовые выбросы промышленных предприятий. Выбросы бывают организованными и неорганизованными. Выбросы, поступающие из труб промышленных предприятий, является специально направленными, организованными. До того как поступить в трубу, они проходят через очистные сооружения, в которых осуществляется поглощение части вредных веществ. Из окон, дверей, вентиляционных отверстий производственных зданий в атмосферу поступают неорганизованные выбросы. Основными загрязняющими веществами в выбросах являются твердые частицы (пыль, сажа) и газообразные вещества (окись углерода, двуокись серы, окислы азота).

Селекция и идентификация микроорганизмов с полезными для определенного производства свойствами является весьма актуальной с экологической точки работой, так как их использование может интенсифицировать процесс или более полно использовать компоненты субстрата.

Сущность методов биоремедиации, биологической очистки, биопереработки и биомодификации заключается в использовании в окружающей среде различных биологических агентов, в первую очередь микроорганизмов. При этом можно применять как микроорганизмы, полученные традиционными методами селекции, так и созданные с помощью генной инженерии, а также трансгенные растения, которые могут влиять на биологическое равновесие природных экосистем.

В окружающей среде могут присутствовать промышленные штаммы различных микроорганизмов - продуцентов биосинтеза тех или иных веществ, а также продукты их метаболизма, которые выступают как биологический фактор загрязнения. Действие его может заключаться в изменении структуры биоценозов. Косвенные эффекты биологического загрязнения проявляются, например, при использовании антибиотиков и других лекарственных средств в медицине, когда появляются штаммы микроорганизмов, устойчивые к их действию и опасные для внутренней среды человека; в виде осложнений при использовании вакцин и сывороток, содержащих примеси веществ биологического происхождения; как аллергенное и генетическое действие микроорганизмов и продуктов их метаболизма.

Биотехнологические крупнотоннажные производства являются источником эмиссии биоаэрозолей, содержащих клетки непатогенных микроорганизмов, а также продукты их метаболизма. Основные источники биоаэрозолей, содержащих живые клетки микроорганизмов, - стадии ферментации и сепарации, а инактивированных клеток - стадия сушки. При массированном выбросе микробная биомасса, попадая в почву или в водоем, изменяет распределение потоков энергии и вещества в трофических цепях питания и влияет на структуру и функцию биоценозов, снижает активность самоочищения и, следовательно, влияет на глобальную функцию биоты. При этом возможно провоцирование активного развития определенных организмов, в том числе микроорганизмов санитарно-показательных групп.

Динамика интродуцированных популяций и показатели их биотехнологического потенциала зависят от вида микроорганизма, состояния почвенной микробной системы в момент интродукции, этапа микробной сукцессии, дозы внесенной популяции. При этом последствия внедрения микроорганизмов, новых для почвенных биоценозов, могут быть неоднозначными. Вследствие самоочищения элиминируется не всякая интродуцированная в почву микробная популяция. Характер популяционной динамики интродуцируемых микроорганизмов зависит от степени их приспособленности к новым условиям. Неприспособленные популяции погибают, приспособленные сохраняются.

Биологический фактор загрязнения можно определить как совокупность биологических компонентов, воздействие которых на человека и окружающую среду связано с их способностью размножаться в естественных или искусственных условиях, продуцировать биологически активные вещества, а при их попадании или продуктов их жизнедеятельности в окружающую среду оказывать неблагоприятные воздействия на окружающую среду, людей, животных, растения.

Биологические факторы загрязнения (чаще всего микробные) можно классифицировать следующим образом: живые микроорганизмы с природным геномом, не обладающие токсичностью, сапрофиты, живые микроорганизмы с природным геномом, обладающие инфекционной активностью, патогенные и условно-патогенные, вырабатывающие токсины, живые микроорганизмы, получаемые методами генной инженерии (генетически модифицированные микроорганизмы, содержащие чужие гены или новые комбинации генов - ГММО), инфекционные и другие вирусы, токсины биологического происхождения, инактивированные клетки микроорганизмов (вакцины, пыль термически инактивированной биомассы микроорганизмов кормового и пищевого назначения), продукты метаболизма микроорганизмов, органеллы и органические соединения клетки - продукты ее фракционирования.

Целью нашей работы явилось выделение и идентификация дрожжевых микроорганизмов в лаборатории биотехнологии Горского ГАУ, относящихся к первой группе выше перечисленных организмов. Так как это микроорганизмы с природным геномом и не обладающие токсичностью, то их воздействие на окружающую среду весьма органично и не значительно.

Источниками микроорганизмов, включая условно-патогенные и патогенные, являются сточные воды (хозяйственно-фекальные, производственные, городские ливневые стоки). В сельских районах фекальные загрязнения поступают со стоками населенных мест, с пастбищ, загонов для скота и птиц и от диких животных. В процессе обработки сточных вод количество патогенных микроорганизмов в них снижается. Масштабы их действия на окружающую среду незначительны, тем не менее поскольку этот источник эмиссии микробных клеток существует, его необходимо учитывать как фактор загрязнения окружающей среды.

Вода, используемая в процессе выполнения нашей работы для приготовления сред, смывов, обогрева автоклава и термостатов может быть очищена на городских очистных сооружениях вместе с городскими сточными водами аэробным или анаэробным способом.

Биологические загрязнители по экологическим свойствам существенно отличаются от химических. По химическому составу техногенные биологические загрязнения тождественны природным компонентам, они включаются в природный круговорот веществ и трофические цепи питания без аккумулирования в окружающей среде.

Все микробиологические и вирусологические лаборатории должны быть оснащены приемником сточных вод, где собирающиеся стоки перед сбросом в городскую канализацию обязательно обезвреживаются химическим, физическим или биологическим методом либо комбинированным способом.

Глава 5 Безопасность жизнедеятельности

Двойная цель техники лабораторной безопасности заключается в защите, как эксперимента, так и экспериментатора, но безопасность человека стоит, конечно, на первом месте.

Из того факта, что обычно используемые бактерии присутствуют в окружающей среде, как будто следует, что они безвредны для человека. Действительно, между непатогенностью и патогенностью нет резкой границы; фактически бактерии имеют широкий спектр степени вирулентности по отношению к человеку. Вчерашний сапрофит сегодня может стать паразитом, а завтра возбудителем заболевания (в качестве примеров можно назвать Escherichia coli, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens и Bacillus cereus). Никогда нельзя забывать, что со всеми бактериями следует работать как с потенциальным источником опасности для здоровья человека.

Мероприятия по предотвращению заражения людей и контаминации окружающего оборудования.

При работе необходимо тщательно выполнять следующие меры предосторожности.

1. Держать двери лаборатории закрытыми.

2. Перед мытьем или повторным употреблением, оборудование, используемое в боксовой работе, должны быть автоклавированы или дезинфицированы.

3. Использовать устройства для набирания жидкости в пипетки.

4. Не есть, не пить и не курить в лаборатории.

5. Мыть руки после работы в лаборатории.

6. Все процедуры и манипуляции выполнять осторожно, сводя к минимуму образование аэрозолей.

7. На соответствующих лабораторных дверях установить знаки биологической опасности. Морозильники, холодильники и другие места хранения патогенных бактерий также должны быть снабжены этим знаком.

8. Надевать защитную одежду или халаты. Не носить эту одежду вне лаборатории.

9. Иметь аптечку экстренной профилактики.

После окончания боксовой работы помещение убирают и облучают бактерицидными лампами в течение 30 − 60 мин. Помещение боксов моют не менее раза в неделю горячей водой с мылом, дезинфицирующими средствами.

Работа с пипетками

Следует использовать безопасные способы применения пипеток. Насасывание раствора пипеткой было причиной бактериального заражения в лабораторных условиях более чем в 17% всех известных случаев.

Дополнительная опасность действия аэрозолей возникает, когда жидкость из пипетки капают на рабочую поверхность, перемешивают культуру чередованием всасывания и выдувания, интенсивно выдувают культуру в чашку или выдувают последнюю каплю из пипетки.

Чтобы использование пипеток было безопасным, применяют дополнительные приспособления, предотвращающие опасность заглатывания, и стараются обращаться с ними осторожно. Существует множество приспособлений к пипеткам− от простых шаровидных груш и поршневых насасывателей до сложных конструкций, имеющих свои собственные насосы, создающие вакуум. При выборе приспособления надо иметь в виду тип операции, которую требуется выполнить, легкость выполнения, а также ее точность.

Предварительно следует отработать технику использования пипеток, чтобы уменьшить возможность образования аэрозолей.

В верхнюю часть пипетки вставляют кусочки ваты и стараются избегать быстрого смешивания жидкостей путем чередования всасывания и выдувания их из пипеток. Нельзя с силой выдувать раствор из пипетки и допускать попадания пузырьков воздуха в жидкость, набираемую пипеткой. Предпочтительнее использовать пипетки, при работе с которыми не требуется выдувания последней капли.

Необходимо также следить за тем, чтобы культуральный материал не капал из пипетки. Можно при работе с суспензиями, содержащими патогенные бактерии, на рабочую поверхность класть полотенце, пропитанное дезинфицирующим веществом. Жидкость из пипеток выливают таким образом, чтобы кончик пипетки находился почти над уровнем жидкости или агара в сосуде − приемнике или раствор стекал по его стенке. Грязные пипетки помещают в емкости с дезинфицирующим раствором, полностью погружая в него.

Правила работы с лабораторным оборудованием.

Центрифугирование

Все лабораторное оборудование должно иметь защиту от статического электричества тока (заземление).

При центрифугировании суспензий следует пользоваться безопасными центрифужными гильзами. Перед центрифугированием проверяют стаканы, и если находят трещины или сколотые края, то такими стаканами не пользуются. Внимательно осматривают внутреннюю поверхность гильз и ликвидируют шероховатости или приставшие частицы. Проверяют также состояние резиновых прокладок.

Не рекомендуется закрывать центрифужные стаканы алюминиевой фольгой, потому что при центрифугировании она часто слетает или рвется.

Стаканы и гильзы необходимо тщательно уравновешивать. Не следует смешивать гильзы, стаканы и пластмассовые вкладыши из разных наборов. Если на этих предметах не указан вес, удобно пометить каждый комплект своей краской.

После включения центрифуги заданную скорость вращения достигают не сразу, а постепенно увеличивая число оборотов ротора. Крышку центрифуги открывают не ранее, чем после полной остановки ротора.

Металл, из которого сделаны высокоскоростные роторы, постепенно изнашивается, и если их используют на разных центрифугах, то для каждого заводят тетрадь, в которой отмечают количество часов работы на предельной или пониженной скорости. Если это не соблюдается, может произойти опасная и дорогостоящая поломка. Чтобы предотвратить коррозию или другие дефекты, которые могут привести к развитию трещин, необходимы частые проверки роторов, их очистка и сушка. Регулярно проверяют состояние резиновых колец и крышек центрифужных стаканов и смазывают их в соответствии с рекомендациями фирмы − изготовителя.

Инструменты

Инструменты, термометры, пипетки и стеклянная посуда перед новым использованием должны быть обеззаражены. В тех случаях, когда перед употреблением необходимо обеззараживание, для дезинфекции используют раствор 2%-ного глутарового альдегида. Предметы полностью погружают в раствор на 20-30 мин. При этом полная безопасность не гарантируется, если предмет не был предварительно вымыт или если раствор уже использовали ранее. Перед повторным употреблением инструменты необходимо тщательно прополоскать в дистиллированной воде. Лабораторные пипетки обеззараживают погружением в дезинфицирующий раствор, налитый в вертикальную или горизонтальную емкость. Стеклянную посуду погружают полностью. Перед использованием стеклянную посуду стерилизуют паром.

Личная гигиена

Еду, конфеты, жевательную резинку и напитки нельзя хранить и употреблять в лабораторных комнатах. Курение в рабочих помещениях запрещено.

Нежелательно, чтобы работающие в лаборатории имели бороду, во-первых, потому что в бороде могут сохраняться частички с бактериями и, во-вторых, потому, что маска или респиратор к чисто выбритому лицу прилегает гораздо лучше, чем к лицу с бородой.

Руки не следует подносить близко ко рту, носу, глазам, лицу и волосам, чтобы предотвратить самозаражение.

Личные вещи, такие, как пальто, шляпы, плащи, уличную обувь, зонты и кошельки, необходимо хранить вне лабораторных помещений.

После снятия защитных перчаток следует немедленно вымыть руки. Проверочные опыты показывают, что, даже когда используют перчатки, не исключено попадание на руки бактерий. Бактерии могут проникнуть через незаметные маленькие дырочки, трещины или разрывы или попасть через край перчатки, прилегающий к запястью.

Руки нужно мыть, сняв запачканную защитную одежду, перед выходом из лаборатории, перед едой иди курением и в течение дня через интервалы, определяемые, характером работы. Желательно мыть руки в дезинфицирующем растворе или погружать их в него, но при этом, конечно, не следует допускать огрубения, чрезмерного высушивания или раздражения кожи.

К работе с бактериями нельзя допускать людей со свежим или старым порезом, ссадиной, повреждением кожи или любой открытой раной, включая образовавшуюся после удаления зуба.

Руки

Для обычного мытья рук в лаборатории, когда не имеют дела с инфекционными агентами, можно применять разные моющие средства. Тщательное мытье рук в течение 15-20 с дезинфектантом приводит к сокращению числа бактерий более чем на 50%.

Мыло в кусках использовать не рекомендуется не только из-за грязи в мыльнице, но также потому, что некоторые микроорганизмы сохраняют жизнеспособность на мыле в течение некоторого времени. Если в резервуар с жидким мылом не добавлять предохраняющих средств, то там могут постепенно вырасти многочисленные популяции бактерий. В этом случае резервуар следует вымыть обычным способом и налить туда новое мыло. Порошковые и листовые мыла имеют то преимущество, что они не загрязняются бактериями, и бактерии не способны расти на них.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1.       Александров А.Н., Влияние качества стеблевых черенков на рост, развитие и урожай хмеля. – Чебоксары: Труды РНИХС. Чувашкнигоиздат 1975. – Вып.5. – С. 84–88.

2.       Альшевский Н.Г., Вержбицкий В.И. Действие кальция, магния и бора на урожай и качество шишек хмеля. Хмелеводство. – К.; Урожай, 1975. – Вып. 5. – 58–60 с.

3.       Альшевский Н.Г., Вержбицкий В.И. Химический состав растений хмеля и использование ими элементов минерального питания при удобрении кальцием, магнием и бором. Хмелеводство. – К.; Урожай, 1979. – Вып. 1. –35–39 с.

4.       Главачек Ф., Лхотский А. Пивоварение. – М.; Пищевая промышленность 1977. –625с.

5.       Шуляр В.М., Рейтман И.Г., Зинчинко С.А. Изменение пивоваренных качеств украинских сортов хмеля в процессе хранения. Биологические основы повышения урожайности сельскохозяйственных культур: Научные труды УСХА. – К.; 1980. – Вып. 245. –128–130 с.

6.       Соловьёва О.И. Теоретические основы товароведения и экспертизы потребительских товаров: Учебное пособие. – Омск: Изд-во ИВМ ОмГАУ, 2003. 304 с

7.       Виноградов В.Н., Сергеев Л. За высокие урожаи хмеля. Земля родная. – М.: 1977. − Вып.1. − 34–36 с

8.        Биотехнология принципы и применение. Под редакцией Хиггинс И., Бест Д., Джонс Д.-М.: Мир, 1988, С. 116.

9.       Остроменьский А.Б. Влияние дополнительной упаковки шишек хмеля в полиэтиленовую пленку на их качество в процессе хранения. Хмелеводство. К.; Урожай, 1979. – Вып.1. –67–70 с.

10.  Щербатенко В. В. Регулирование технологических процессов производства хлеба и повышение его качества. — М.: Пищевая промышленность, 1976. — 232 с Довгань В.Н. Книга о пиве.– Смоленск: Русич, 1996.– 576с

11.  Рейтман И.Г. Вопросы теории сушки хмеля. Хмелеводство. – К.; Урожай, 1975. – Вып. 4. –79– 96 с.

12.  Либацкий Е.П Хмелеводство. М. Колос 1993. –279 с.

13.  Бондаренко В.М. К вопросу содержания горьких веществ в шишках хмеля. Тр. УНИСХ. – 1959. –Вып. 6. –101–109 с.

14.  Вержбицкий В.И., Полищук В.Д. Образование отдельных компонентов горьких веществ в органах хмеля. Хмелеводство. – К.; Урожай, 1975. − Вып.1. −40- 45 с.

15.  Альшевский Н.Г., Москальчук Н.И. Магний в питании хмеля. Хмелеводство. 1982. – Вып.4. –23–27 с.

16.  Аркадьева З.А., Безбородов А.М., Блохина И.Н. и др. Промышленная микробиология. Под ред. Н. С. Егорова. – М. Высш. шк., 1989. –688 с.

17.  Бабицкая В.Г., Стахеев И.В. Микробиологическая промышленность.- М.: ОНИТЭИ Микробиопром, 1977, № 11, –32 С.

18.   Бабьева И.П., Голубев В. И. Методы выделения и идентификации дрожжей.м.: Пищевая пром-сть, 1979. – 120 с.

19.   Барабай В.А. Биологическое действие растительных фенольных соединений. – К.; Наук. думка, 1976. – 270 с.

20.  Крылова М.И., Батудаева Э.А. Выращивание саженцев хмеля из зеленых черенков. Научные труды РНИХС, вып.6. М.: 1982.

21.  Биотехнология принципы и применение. Под редакцией Хиггинс И., Бест Д., Джонс Д.М.: Мир, 1988, С. 116.

22.   Коновалов С.А. Биохимия бродильных производств.- М.; Пищевая промышленность, 1967.

23.   Коновалов С.А. Биохимия дрожжей. – М.: Пищевая промышленность, 1962. –269 с.

24.   Андреев А.А., Брызгалов Л.И. Производство кормовых дрожжей. 3- е изд. перераб. и доп. – М.: Лесная пром-сть, 1986.– 248 с.

25.  Безбородов А.М. Биотехнологические основы микробиологического синтеза.– М.: Лег. и пищ. пр-сть, 1984, 204 с.

26.   Воробьева Л.И. Техническая микробиология. Учеб. пособие. – М.:Изд-во МГУ,1987.– 168 с.

27.   Воробьева Л.И.Промышленная микробиология. Учеб. пособие.- М.: Изд-во МГУ, 1989 – 294 с.

28.  Жвирблянская А.Ю., Исаева В.С. Дрожжи в пивоварении. М.; Пищевая промышленность, 1979. –246 с.

29.  Справочник по виноделию (Под ред. Г.Г. Валуйко и В.Т. Косюры). – Симферополь: Таврида, 2000. – 624 с.

30.   Теория и практика виноделия Ж.Риберо-Гайон, Э.Пейно, П.Риберо-Гайон, П.Сюдро. – М. Пищевая промышленность, 1979. – Т.2. – 352 с; 1980, т. 3. – 480 с., 1981, т. 4 – 414 с.

31.   Фертман Г.И., Шойхет М.И, Химико-технологический контроль спиртового и ликеро-водочного производства. – М.:Пищевая промышленность, 1975. – 440 с.

32.   Фараджева Е.Д., Болотов Н.А. «Производство хлебопекарных дрожжей» Санкт-Петербург 2002

33.   Семихатова Н. М., Малыгина М. В. Микробиология дрожжевого производства. М., «Пищевая промышленность», 1970.

34.   Розманова Н.В., Бочарова Н.Н. Новые методы микробиологического контроля дрожжевого производства. — В кн.: Новое в микробиологии и технологии дрожжевого производства. М., ЦИНТИ пищепром, 1967.

35.   Малков А. М. Технология хлебопекарных и кормовых дрожжей. М.,Пищепромиздат, 1962.

36.  Грачёва. И.М. Технология микробных белковых препаратов, аминокислот и биоэнергия И.М. Грачёва, Л.А. Иванова. В.М. Кантере – 2– е изд., перераб. и доп. – М: Колос,1992. –383 с.

37.  Гриневич. А.Г., Босенко. А.М. Техническая микробиология. Учеб. пособ. для технол. вузов – Мн.: Высш. шк. 1986.–168 с.

38.  Инструкция по микробиологическому и технохимическому контролю дрожжевого производства. М. “Легкая и пищевая промышленность”, 1978, 165 с.

39.  Новаковская С. С.. Справочник технолога дрожжевого производства. М. “Пищевая промышленность” 1973, 269с.

40.   Пименова М. К, Гречушкина Н. Н.,Азов а Л. Г. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. Изд-во МГУ, 1971.

41.   Работнова И. Л. Общая микробиология. М., «Высшая школа», 1966.

42.   Романе I к о В. И., Кузнецов С. И. Экология микроорганизмов пресных, водоемов. Лабораторное руководство. Л., «Наука», 1974.

43.   Роуз Э. Химическая микробиология. М., «Мир», 1971.

44.  Ляшенко Н.И. Биохимическая характеристика некоторых сортов хмеля. Прикладная биохимия и микробиология. – 1977. – № 1. С.118 –123.

45.  Ляшенко Н.И. Изменение горьких веществ в цветках и шишках хмеля. Физиология и биохимия культурных растений. – К.; Наук. думка. 1976. –Т.8, вып. 3. –307–312 с.

46.  Шлегель Г. Общая микробиология. М., «Мир», 1972.

Для выполнения работы были использованы следующие Интернет сайты:

47.   #"#">#"#">#"#">#"#">#"#">#"#">#"#">#"#">#"#">#"#">#"#">#"#">#"#">#"#">#"#">#"#">#"#">#"#">#"#">#"#">#"#">#"Рисунок 3" src="1.files/image002.jpg">

Страницы: 1, 2, 3