Выделение чистых культур дрожжевых грибов из шишек хмеля

Убихиноны - группа соединений, в которых к 2,3-диметоксил-5-метилбензоксихинону присоединена в 6 положении боковая цепь из нескольких изопреноидных остатков. У известных гомологов кофермента Q количество изопреноидных остатков варьирует от 5 до 10. По количеству изопреноидных остатков различают до шести типов кофермента Q от Q-5 до Q-10. У базидиомицетовых дрожжей обнаружен также дигидрогенированный гомолог кофермента Q с насыщенной двойной связью в изопреноидных остатках, обозначаемый как Q-10 (H2). Кофермент Q выделяют с помощью тонкослойной хроматографии из гексанового эктракта гидролизованных клеток дрожжей. Для определения типа кофермента Q используют различные хроматографические методы, включая жидкостную, тонкослойную и бумажную хроматографию, а также масспектрометрию.

Тип кофермента Q оказался очень полезным признаком для классификации дрожжей и дрожжеподобных грибов. Прежде всего, он различен у аскомицетовых и базидиомицетовых дрожжей. У первых преобладают убихиноны с 5-7 изопреноидными остатками (Q-5 - Q-7), у вторых - с 8-10 (Q-8 - Q-10). Однако, имеются и исключения, например, убихинон Q-10 обнаружен у представителей родов Lipomyces и Schizosaccharomyces. Особенно важную роль сыграл тип кофермента Q в классификации анаморфных дрожжей на родовом уровне. Считается, что этот признак не должен существенно варьировать внутри рода, и отличия по типу кофермента Q достаточно для отнесения видов к разным родам в том случае, когда это сопровождается и другими существенными различиями, например, по морфологическим признакам.

Определение типа кофермента Q, вместе с изучением моносахаридного состава клеточных стенок сыграло решающую роль в переклассификации родов анаморфных баллистоспоровых дрожжей (Bensingtonia, Bullera, Sporobolomyces, Udeniomyces), дрожжей, характеризующихся образованием почек на стеригмах (Sterigmatomyces, Fellomyces, Kurtzmanomyces). Все эти роды характеризуются одним типом кофермента Q. В то же время, в таких родах, как Cryptococcus, Candida, тип кофермента Q варьирует по видам, что подтверждает их условность и филогенетическую гетерогенность.

Развитие методов электронной микроскопии позволило использовать для классификации дрожжей ряд цитологических признаков. Выше уже были рассмотрены такие характеристики, как ультраструктура клеточной стенки, цитологические особенности образования почки (голобластическое и энтеробластическое почкование), которые оказались различными у аскомицетовых и базидиомицетовых дрожжей. Еще одним важным цитологическим признаком является ультраструктура септ мицелия у диморфных дрожжеподобных грибов. Деление клеток мицелия начинается с образования тонкого кольца на клеточной мембране. Кольцо начинает центростремительно расти и разделяет клетку. Затем на внешней поверхности мембраны откладывается вновь синтезируемый материал клеточной стенки, формируя септу.

Детальные исследования, проведенные с помощью электронной микроскопии, показали, что ультраструктура этих септ существенно различается у разных групп грибов и может служить хорошим критерием для их филогенетической классификации.

В гифах аскомицетовых дрожжеподобных грибов септы в основном гомогенные и электроннопрозрачные. В септах имеются поры, которые достаточно велики для прохода ядер. С обеих сторон поры часто располагаются мелкие мембранные пузырьки, так называемые тельца Воронина. Гифы дрожжеподобных грибов рода Ambrosiozyma имеют септы с сильно утолщенным центральным участком. У некоторых дрожжеподобных грибов в центре сформированной септы имеется лишь очень узкий мембранный канал, так называемая микропора. У других видов в септе могут формироваться множественные каналы - плазмодесмы. Наличие таких плазмодесм явилось важным свидетельством о наличии филогенетической связи анаморфного рода Zygozyma с семействами Lipomycetaceae и Dipodascaceae.( Гречушкина Н.).

У большинства базидиомицетовых дрожжей в центре септы формируется пора, имеющая сложное строение: края септы раздуты в виде тора, а с двух сторон поры имеются характерные мембранные образования - парентосомы. В некоторых исследованиях было показано, что тороидально раздувшиеся септы (долипоры) на самом деле представляют собой артефакт химической фиксации, используемой при подготовке образцов к электронной микроскопии. Такие бочкообразные вздутия отсутствовали в образцах, подготовленных с помощью быстрого замораживания. Тем не менее, эти артефакты четко воспроизводятся у одних и тех же видов, коррелируют с другими таксономическими признаками и поэтому могут использоваться в систематике. Тонкое строение комплекса долипор и парентосом служит важным диагностическим признаком для классификации базидиомицетовых дрожжеподобных грибов.

Аскомицетовые и базидиомицетовые грибы легко отличить по характеру полового размножения: формированию эндогенных спор в асках у аскомицетов и экзогенных спор на базидиях у базидиомицетов. Аналогичные структуры формируют при половом размножении и дрожжевые грибы. Поэтому особую сложность для классификации представляют анаморфные дрожжи, у которых отсутствует половая стадия в жизненном цикле. Формально такие грибы относят к особому классу Deuteromycetes, однако по сути они представляют собой лишь стадии в полном жизненном цикле аскомицетов или базидиомицетов. Половое размножение у таких дрожжей может отсутствовать по разным причинам. Во-первых, многие дрожжи гетероталличны, и для осуществления полового процесса необходимы штаммы разных типов спаривания. В чистой культуре таких дрожжей, представленной только одним типом спаривания, половое размножение невозможно. Во-вторых, половой процесс может запускаться лишь в определенных условиях, например, при наличии определенных химических факторов, которые могут отсутствовать в лабораторной среде. Наконец, у многих видов способность к половому размножению, по-видимому, вообще утеряна в ходе эволюции.( Грачёва. И.М.).

По совокупности морфологических и физиологических признаков, которые использовались на первых этапах развития систематики дрожжей, отличить аскомицетовые и базидиомицетовые дрожжи в анаморфном состоянии было практически невозможно. Это привело к тому, что некоторые крупные роды несовершенных дрожжей включали анаморфы как аскомицетов, так и базидиомицетов. В первую очередь это относится к роду Candida, описанному в 1923 г. Диагноз рода был очень расплывчатым: «Немногочисленные гифы, стелющиеся, распадающиеся на короткие и длинные фрагменты. Конидии, возникающие путем почкования из гиф или на вершине одна другой, мелкие и бесцветные». Под такое описание подходили самые различные дрожжеподобные грибы, и поэтому в дальнейшем оказалось возможным включение в этот род многих видов, явно неродственных друг другу. К 1970 г., в котором был выпущен полный определитель дрожжей дельфтской школы, количество видов, включенных в род Candida, возросло до 81, и он стал самым многовидовым родом среди дрожжей.( Азов а Л. Г.).

Второй по числу видов дрожжевой род Torulopsis существовал с 1895 г. и объединял аспорогенные дрожжи, не соответствующие описанию рода Candida только по одному признаку - отсутствию способности к образованию субстратного септированного или псевдомицелия. При росте на плотных средах мицелиальность настолько меняет облик колонии дрожжеподобных грибов, что на начальном этапе систематики дрожжей, когда основной упор делался именно на морфологические характеристики, этому признаку безусловно был придан статус родового. Однако с увеличением разнообразия описанных видов стало ясно, что способность к образованию псевдомицелия крайне ненадежный, сильно варьирующий в зависимости от штамма и от условий культивирования признак, имеющий низкую таксономическую ценность. В связи с этим в 1978 г. было предложено объединить роды Candida и Torulopsis в один род. Это было осуществлено в следующем издании определителя дрожжей, где был представлен единый род Candida, включающий 196 видов и заведомо полифилетический. Наиболее вескими аргументами полифилетичности рода были обнаружения совершенных стадий для некоторых видов Candida, которые, как оказалось, соответствовали различным родам известных аскоспоровых дрожжей. Такие пары анаморфа - телеоморфа включали, например Candida famata - Debaryomyces hansenii, Candida pulcherrima - Metschnikowia pulcherrima, Candida robusta - Saccharomyces cerevisiae и др. В 1966 г. новозеландская исследовательница Ди Менна описала три новых вида Candida gelida, Candida nivalis, Candida frigida, выделенные ею из антарктических почв. Всего несколько лет спустя у этих дрожжей также были обнаружены совершенные стадии, которые свидетельствовали об их принадлежности к базидиальным грибам. Таким образом, род Candida оказался группой несовершенных дрожжей, объединяющей анаморфы как аскомицетов, так и базидиомицетов.( И.М. Грачёва, Л.А. Иванова. В.М. Кантере.).

После доказательства полифилетической природы таких крупных дрожжевых родов, как Candida, в зимологии начался активный поиск признаков, которые могли бы дифференцировать анаморфы аско- и базидиомицетов. К настоящему времени в систематике дрожжей используется целый набор таких признаков аффинитета, благодаря которым все дрожжи удается четко разбить на две группы - аскомицетовые и базидиомицетовые, независимо от телеоморфного или анаморфного состояния культуры.

Развитие методов секвенирования рРНК окончательно решило проблему определения аффинитета несовершенных дрожжей. Одно из главных преимуществ систематики, основанной на сравнении нуклеотидных последовательностей консервативных генов - возможность классификации на одной и той же основе как совершенных видов дрожжей, обладающих полным жизненным циклом, так и их анаморф.( Розманова Н.В., Бочарова Н.Н.).

Вновь описываемые виды должны типифицироваться штаммами, которые помещают в крупные коллекции, где они поддерживаются в живом состоянии. Это делает их доступными для научной общественности. Кроме хранилищ таких штаммов коллекции выполняют различные функции: научные, учебные, производственные. Они проводят патентование практически ценных штаммов, осуществляют обмен и выдачу культур для разных целей, проводят таксономические исследования, составляют периодически публикуемые каталоги. Коллекции дрожжей различаются как по своему объему, так и по направленности. Есть очень крупные, хорошо известные в научном мире коллекции, где проводятся широкие исследования по систематике дрожжей, разрабатываются способы наилучшего хранения штаммов. Есть и небольшие, но очень ценные коллекции, где собраны штаммы с конкретной целью, служащие для выполнения специальных исследований.( Жвирблянская А.Ю., Исаева В.С.).

Крупнейшая коллекция дрожжей - CBS (Centraalbureau voor Schimmelcultures). Эта коллекция была создана в 1904 г. по решению 11-го международного Ботанического Конгресса в Вене. Она поддерживается Королевской Нидерландской Академией Искусств и Наук и до 2000 г. располагалась на родине Левенгука в г. Дельфте. В настоящее время коллекция CBS находится в г.Утрехте и является мировым центром по изучению систематики дрожжей. Главным образом на базе этой коллекции была создана серия определителей дрожжей, содержащих описания всех известных видов и диагностические ключи для их идентификации.( Бабьева И.П., Голубев В. И.).

Среди других крупных коллекций дрожжей ВКМ (Всероссийская коллекция микроорганизмов) и ВКПМ (Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов) в России, ATCC (American Type Culture Collection) в США, IFO (Institute of Fermentation in Osaka) в Японии, CCY (Culture Collection of Yeasts) в Словакии, NCYC (National Collection of Yeast Cultures of the United Kingdom) в Англии. Существует также ряд крупных специализированных коллекций дрожжей, например, генетически модифицированных штаммов Saccharomyces cerevisiae, штаммов, используемых в виноделии и других биотехнологических процессах.

Основная проблема, с которой сталкиваются работники микробиологических коллекций - необходимость длительного поддержания чистых культур в жизнеспособном состоянии. Для хранения дрожжевых культур используются разные методы, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки.( Бабицкая В.Г., Стахеев И.В.).

Наиболее доступный и широко применяемый метод хранения - поддержание культур путем их периодических пересевов, обычно в пробирках со скошенным агаром. Сроки пересевов определяются скоростью высыхания среды и зависят от температуры и влажности помещения. Промежутки между пересевами можно увеличить за счет более плотного закупоривания пробирок и снижения температуры хранения. Хранение в холодильной камере при температуре около 5°C дает возможность увеличить сроки пересевов до 2-3 лет. Для предотвращения высыхания культур используют заливку культур минеральным маслом. Этот способ позволяет сохранять культуры большинства видов дрожжей без пересевов в течение 10 и более лет.( Аркадьева З.А.).

Другой способ, используемый для длительного хранения дрожжевых культур - лиофилизация, то есть высушивание под вакуумом из замороженного состояния. Лиофилизированные культуры хранят в запаянных стеклянных ампулах при комнатной температуре или в холодильнике. Такие культуры могут сохраняться в жизнеспособном состоянии в течение нескольких десятилетий.

Недостатком этого способа является невозможность визуального контроля за жизнеспособностью культуры. Кроме того, не все виды дрожжей выдерживают процесс лиофилизации, а при длительном хранении лиофилизированных культур могут происходит существенные изменения в их метаболизме.( Хиггинс И., Бест Д., Джонс Д.М).

В последнее время все шире применяется еще один способ длительного хранения культур микроорганизмов - замораживание в жидком азоте. Замороженные в ампулах культуры хранят в специальных контейнерах-рефрижераторах с жидким азотом при температуре -196°C. Такой способ позволяет сохранять жизнеспособные культуры дрожжей в течение практически неограниченного времени.( Безбородов А.М.).

Определение видовой принадлежности дрожжей - сложная процедура, требующая не только большого опыта, но и, как правило, достаточно длительных лабораторных исследований, связанных с постановкой серии тестов для определения рассмотренных выше морфологических, физиологических и биохимических признаков. Лишь после составления достаточно полного описания штамма возможна его надежная видовая идентификация. В последнее время для идентификации дрожжей по таким описаниям, наряду с традиционными дихотомическими ключами, широко используются компьютерные технологии нумерической идентификации. Такая идентификация может осуществляться на основе любой СУБД (средство управления базами данных), в которую внесены стандартизованные признаки всех видов дрожжей. В процессе идентификации программа поочередно сравнивает описание идентифицируемого штамма с описанием каждого вида и высчитывает уровень сходства (долю совпавших признаков от общего количества использованных признаков). Результирующая информация представляет собой список видов, ранжированный по уровню сходства с идентифицируемым штаммом. Существуют специализированные программы для идентификации дрожжей. (Розманова Н.В., Бочарова Н.Н.).

Некоторые коллекции дрожжей предоставляют возможность поиска наиболее сходных штаммов с использованием Интернета. В последние годы бурно развивается система генобанков, доступных также через Интернет, позволяющих искать наиболее сходные нуклеотидные последовательности. Однако следует помнить, что при идентификации с использованием таких формальных процедур возможны серьезные ошибки, поэтому для надежного определения вида дрожжей необходима консультация со специалистом-систематиком, имеющим большой опыт изучения разнообразия этих организмов. В первую очередь это относится к идентификации штаммов, выделенных из природных местообитаний.

2 Общая характеристика хмеля

Humulus lupulus L

Название рода humulus – средневековое латинизированное славянское или голландское наименование хмеля, латинское “lupulus” – от итальянского “luppolo” – хмель.

Двудомное многолетнее травянистое вьющееся растение (лиана). Стебель длиной до 3 – 6 м, гранистый, цепкошероховатый от загнутых шипиков. Корневище мясистое, ползучее.

Листья супротивные, на верхушечных ветках иногда очередные, черешковые, округлые или овальные, трех-, пятипальчатолопастные, по краю крупнопильчатые с остроконечными зубцами, сверху темно-зеленые, острошероховатые, снизу более бледные, железистые, по жилкам с редкими острыми цепкими шипиками. Черешки длинные, шероховатые. (Н.И. Ляшенко, 1976).

Цветки мелкие, однополые; растение двудомное – пестичные и тычиночные цветки развиваются на разных экземплярах. Тычиночные (мужские) цветки на тонких цветоножках, поникшие, с пятичленным, желтовато-зеленым околоцветником, расположены пазушными верхушечными висячими метелками. Пестичные цветки (женские) на очень коротких цветоножках находятся в коротких пазушных колосках, длиной 2 – 3 см. Околоцветник малозаметный, чашевидный, плотно охватывает нижнюю половину завязи. Прицветники после цветения разрастаются, образуя “шишки”. Плод – килеватый сплющенный орешек. “Шишки” несут желтые железки. Цветет в июле – августе. (В.М. Шуляр, И.Г. Рейтман, С.А. Зинчинко, 1980).

Растет по берегам рек в зарослях кустарников и по опушкам пойменных лесов. Распространен почти по всей европейской части России, на Кавказе, в Сибири, Средней Азии. Широко возделывается на Украине, в Беларуси, Поволжье, Восточной и Западной Сибири, в центрально-черноземных областях, на Алтае и Кавказе. (А.Н. Александров, 1975)

Заготовляют шишки в начале созревания (август, начало сентября), срывая руками, когда они еще зеленовато-желтого цвета. Сушат быстро под открытым небом, в тени, на чердаках или под навесом с хорошей вентиляцией, расстилая их тонким слоем на мешковине или бумаге. Лучшее сырье получается при сушке в сушилках. Не следует забывать, что хмель ядовит.

Железки, находящиеся на составных частях соплодий (“шишках”), во время созревания легко отделяются. Путем отряхивания “шишек” и просеивания получают зеленовато-желтый порошок из железок, называемый лупулином. Железки, иногда называемые липучки, составляют 7—16% массы сухих “шишек”.(В.Н. Виноградов, Л.Сергеев, 1977)

Корневая система вегетативно размножаемых растений хмеля состоит из 10-12 и более сильно разветвленных толстых скелетных корней, покрытых корообразным слоем. Корни отрастают из главного корневища – подземного видоизмененного побега. Скелетные корни многократно ветвятся на более тонкие корни с густой сетью мелких корешков и образуют мощную корневую систему, проникающую в глубину до 4 метров и в ширину до 3 метров.

Конечные разветвления корешков имеют корневой кончик, который постоянно нарастает. За корневым кончиком расположена небольшая всасывающая зона корешков, покрытая корневыми волосками, которые представляют собой отростки клеток эпидермиса с очень тонкой оболочкой.

Корневые волоски, поглощающие воду и питательные вещества из почвы, перемещаются за растущим кончиком корня.

По данным Крыловой М.И.(С.А. Коновалов, 1962) и других исследователей после отмирания корневых волосков на поверхности корешка остается только первичная корка, клетки которой имеют корообразные стенки и защищают внутреннюю ткань корня от повреждений и высыхания.

Кроме того, на подземной части стеблей, главном и боковых корневищах образуются мелкие мочковатые корешки, произрастающие главным образом в пахотном горизонте. Они покрыты тонким корообразным слоем, имеют более светлую окраску, чем скелетные корни. Многолетние корни хмеля являются резервными органами. В толстых корнях и в особых корневых утолщениях накапливаются запасные питательнее вещества. Эти корневые утолщения образуются на корнях примерно, на расстоянии 40 см от главного корневища и имеют продолговатую форму.

В течение вегетационного периода по данным И.Г. Рейтмана, Н.И. Ляшенко, М.А. Кулинич (1983), у хмеля наблюдается два периода роста корней - весеннее – летний и осенний. Первый период предшествует активному росту надземной массы и сопровождается усиленным приростом корней в длину. Вторая волна роста корней - осенняя, в период затухания роста стеблей. В этот период особенно усиленно идет процесс накопления общей массы корней и отложения в ней запасных питательных веществ.

Виноградов В.Н. (1977) утверждает, что главное корневище хмеля представляет собой многолетний подземный орган побегового происхождения (ботаническое название каудекс) с расположенными на нем почками. У плодоносящего растения его диаметр достигает 15 см. С возрастом главное корневище разрастается и сильно деревенеет, причем в год посадки разрастание главного корневища вначале происходит медленно, а после образования мощной надземной части растения- более интенсивно. Самым большим прирост главного корневища хмеля бывает в первые 3-4 года после посадки растения. Именно в этот период на нем образуется наибольшее количество почек.

По некоторым данным на главном корневище хмеля ежегодно образуются боковые корневища – видоизмененные, развивающиеся в горизонтальном направлении подземные побеги с почками. Боковые корневища имеют относительно короткие междоузлия, они развиваются за счет резервных веществ подземной части растения.

Стебли у хмеля тонкие, длинные вьющиеся лианы. При толщине не более 13 мм, они достигают в длину 10-12 метров, а потому не могут самостоятельно держаться вертикально и пользуются для этого соседними растениями или другими опорами.

Характерной особенностью строения стебля хмеля как лианы является отсутствие прочного скелета, наличие крупных длинных проводящих сосудов и облегченная масса растения за счет небольшого запаса питательных веществ в самих стеблях и полного их строения. Прочность и гибкость стебля хмеля по данным (Либацкого Е.П. А.Б. Остроменьский 1979) обеспечивается особенностью его строения: наличием лубяных волокон в стенках стебля и диафрагм в его узлах.

Побег хмеля представляет собой стебель с листьями и другими расположенными на нем органами, имеет свои особенности.

Листья у хмеля простые черешковые с небольшими прилистниками у основания. Черешки листьев имеют ту же окраску, что и стебли. Поверхность листовой пластинки пальчатораздельная, у основания сердцевидной формы (А.Б Остроменьский, 1979).

Соплодия (“шишки”) хмеля содержат 0,3—1,8% эфирного масла, 11—21% горечей, называемых общими смолами. Компонентами этих “смол” являются кислоты: гумулон, когумулон, адгумулон и другие, горькое вещество лупулин, сесквитерпены. Кроме того, соплодия содержат валериановую и гумуленовую кислоты, следы алкалоидов (алкалоид хумулин), холин, дубильные вещества (3,5%). Фенольные соединения представлены флавоноидами (кемпферол, кверцетин и их гликозиды, лейкоцианидин, лейкодельфинидин), кумаринами, фенольными кислотами.

Мужские соцветия хмеля представляют собой сильно разветвленную метелку, на которой по одиночке на коротких цветоножках расположены мелкие цветки. На одном мужском растении находится очень большое количество цветков. Мужские цветки начинают цвести на 3-4 дня раньше женских (В.Н. Виноградов, Л. Сергеев, 1977). Свежесобранный хмель содержит большое количество воды (около 75%), хмелевые смолы, дубильные вещества и эфирное масло, участвующие в технологическом процессе при производстве пива и являющийся ценным сырьем используемым в медицине, косметологии и идругих отраслях промышленности (В.И. Вержбицкий, В.Д. Полищук, 1975).

В литературе есть данные согласно которым до 1950 года были известны только две составляющие группы хмелевых смол, первоначально считавшиеся химическими индивидуумами (В.М. Бондаренко 1959), а именно альфа-горькая кислота, или гумулон и бета-горькая кислота или лупулон.

Сбор хмеля начинается, как только шишки закрываются и приобретают желто-зеленую окраску, а также клейкость и аромат. В зависимости от месяца произрастания наиболее благоприятное время для сбора шишек – август − сентябрь. Ощипанные шишки содержат много воды, поэтому их сушат (обычно в специальных сушилках, можно и в печи) при температуре никак не выше 50°С.

Однако А.Б. Остроменьский (1979) указывает на быстрое снижение качества хмеля после наступления технической зрелости, в связи, с чем рекомендует сжатые сроки уборки (10-15 суток).

К такому же выводу пришли В.М. Шуляр, И.Г. Рейтман, С.А. Зинчинко (1980) которые исходя из результатов своих исследований рекомендуют убирать хмель в течении 6-8 суток.

У большого числа сортов хмеля цианидины, или цианигены во много раз преобладают над делфинидином или делфинигеном .

Было установлено Е.П Либацкий (1993), что хмель содержит катехин, эпикатехин и их полимеры. По данным Роллмана (1966) катехин является вторым компонетом основного бифлавоидного антоцианогена хмеля.

Хмелевое эфирное масло придает хмелю характерный аромат, это сложная смесь углеводородов и кислородсодержащих соединений.

С помощью газовой хроматографии постепенно удалось идентифицировать большое число компонентов хмелевого эфирного масла. По данным Лященко (Н.И. Ляшенко, 1977) их насчитывается около двухсот.

Углеводородная (терпеновая) фракция составляет от 40 до 80% хмелевого эфирного масла. Как правило, половина этой фракции - это монотерпены, остаток – главным образом секситерпены. Основной монотерпен- это мирцен, основные сексвитерпены – кариофилены, гумулен и фарнезен. Образование и качественный состав хмелевого эфирного масла также как и горьких веществ является генетическим свойством отдельных сортов хмеля (F. Drawert, J Beier, J Beier, 1973).

По некоторым данным A.H. Burgess (1967) мирцен придает пиву резкий запах и жесткий вкус, в то время как гумулен и кариофилены придают пиву благородный аромат. Соотношение кариофиленов, гумулена и фарнезена зависит у одного и того же сорта хмеля от района его произрастания (Д.А. Гарбузова, 1959).

В состав кислородсодержащей фракции входят спирты, альдегиды и сложные эфиры спиртов.

Основной, с технологической точки зрения несущественной частью хмелевых шишек является клетчатка (целлюлоза). Из других высокомолекулярных полисахаридов хмель содержит от 12 до 14% пектина. Из растворимых сахаридов в сухом веществе хмеля содержится: 0,5% фруктозы, 0,4% глюкозы, 0,5% сахарозы Б.В. Лесик, И.Г. (Рейтман, В.М. Шуляр, 1983).

В хмеле были обнаружены эстрогенный гормон (от 2 до 30 мг на 100 грамм хмеля) и некоторые витамины, а именно тиамин, биотин, пиридоксин, пантотеновую и пантотеновую кислоты. По содержанию токоферолов (витамина Е) хмель превосходит зародыши пшеницы служащие сыръем для получения токоферолов. Если в зародышах пшеницы их содержание примерно 30 мг %, то по данным Ежова И.С. в зависимости от сорта оно варьирует от 18 до 71 мг%. Кроме токоферолов в хмеле содержатся водорастворимые витамины: С, В1, В3 , В6, РР и Н (А.Ю. Жвирблянская, В.С. Исаева, 1979). Химический состав по некоторым данным в различных частях растения неодинаков. Установлено, что содержание горьких веществ в шишках хмеля уменьшается от верхних частей растений к нижним, больше всего их содержится в шишках верхней части растения, меньше – в шишках средней части растения и еще меньше в нижней части.

Режим сушки для сохранения качеств хмеля, как и своевременная уборка, имеет первостепенное значение. Особенно осторожно следует обращаться с чересчур сырым хмелем, при сушке которого можно потерять хмелевое масло, которое легко испаряется. Хмелевая мука буреет и разрушается уже при 37°С. Высушенный хмель содержит 10…12% влаги. Для хранения его упаковывают в мешки (желательно из джута) или прессуют.

Теперь о качестве хмеля. У хорошего хмеля - однородные закрытые шишки среднего размера зеленого или желто-зеленого цвета. Лепестки шишек нежные, с приятным ароматом, богаты хмелевой мукой. Когда у шишек явно ощущается запах чеснока, то хмель плохого качества. Если разломить шишку и провести по тыльной стороне руки, то на руке останется след, образуемый лупулином. Сжатый в руке хмель не рассыпается (он склеивается), причем не производит ощущения влажности. Конечно, недопустимо в собранном хмеле присутствие заплесневелых шишек, листьев и стеблей растения, а также разных посторонних предметов, как растительного, так и животного происхождения. (В.И. Вержбицкий, В.Д. Полищук, 1975).

Химический состав хмеля

Показатели в %: Влажность − 10-11; Общие смолы − 10-25; Эфирные масла − 0,4 – 2; Липиды и воска − около 3;Азотистые вещества − 12-22; Полифенольные вещества − 4-14;Углеводы 2-4; Минеральные вещества − 7-10 Целлюлоза − 10-17.

Состав хмеля в сухом виде имеет следующее процентное содержание:

горьких веществ 18,5%;

хмелевого эфирного масла 0,5%;

дубильных веществ 3,5%;

белка около 20%;

минеральных веществ 8%.

Остальное, это целлюлоза и другие вещества, не имеющие особого значения для производства пива. Из общего состава наибольший интерес и исключительную ценность представляют горькие вещества, хмелевое масло и полифенольные (дубильные) вещества. (Н.И. Ляшенко 1976 )

Полифенольные вещества хмеля играют важную роль в защите горьких веществ от окисления и не позволяют образовываться комплексным соединениям. Так же их преимущество в антибиотических свойствах и придании вяжущего вкуса. В процессе производства пива полифенолы способствуют осаждению белка сусла, что благоприятно сказывается на его осветлении. Но вместе с тем отрицательными свойствами полифенольных веществ является то, что с солями железа и при окислении они образуют соединения темного цвета, а так же могут послужить причиной образования мути в пиве. Не смотря на это присутствие полифенольных веществ в пиве очень желательно из-за положительного влияния на создание характерного вкуса пива. (З.А. Аркадьева, А.М. Безбородов, И.Н. Блохина 1989).

Исходя из требований к качественному пиву при его приготовлении, необходимо содержание в используемом хмеле не менее 4,5% полифенолов. Но в этом случае так же учитывается, что при слишком большем процентном содержании у приготовляемого пива может появиться неприятная горечь. Если используется хмель с высоким содержанием полифенольных веществ, то рекомендуется обработать его перед использованием в течение 2 мин. кипяченой водой (А.Б. Остроменьского1979).

Хмелевое эфирное масло придает хмелю присущий ему специфический аромат. Под ним подразумевается от 200 до 250 различных эфирных веществ, легко улетучивающихся при кипячении и придающих пиву желательный ароматный оттенок, зависящий от типа пива. (Н.И Ляшенко, 1977).

Различают два основных вида хмеля: горький и ароматический. В пивоварении используют преимущественно женские соцветия ароматического хмеля – хмелевые шишки, содержащие лупулин. В состав последнего входят ароматические и горькие вещества.

Горькие хмелевые вещества включают [pic]- и [pic]-кислоты. мягкие [pic]-, [pic]- и твердые смолы. Содержание [pic]-кислот в зависимости от сорта хмеля может достигать 16 %. Наиболее ценные для пивоварения производные [pic]-кислот – изосоединения обеспечивают около 90 % горечи пива. (И.Г. Рейтман 1979)

Ароматические вещества представлены в основном эфирным маслом, содержание которого колеблется от 0,3 до 2 %. Важная составная часть хмеля дубильные вещества, количество которых достигает 3 %.

По назначению хмель разделяют на две группы: тонкие сорта с содержанием горьких веществ около 15 % и [pic]-кислот от 3 до 5 %, используемые для производства пива по классической технологии, и грубые сорта с содержанием горьких веществ более 20 %, предназначенные для изготовления порошков, гранул и экстрактов. В пивоварении используют высушенные хмелевые шишки, молотый, гранулированный или брикетированный хмель, а также различные хмелевые экстракты. Исследованиями Б.В. Лесик, И.Г. Рейтмана, В.М. Шуляра (1983) установлено, что максимальное количество альфа - кислот в хмеле находилось в период технической зрелости. К аналогичным выводам пришли F. Drawert, J. Beier, J. Beier, (1973) которые установили что в этот период содержание альфа - кислот практически постоянное.

Ляшенко Н.И., и Кулинич М.А. (1976) изучили динамику накопления отдельных компонентов эфирного масла. Ими было доказано, что в начале образования эфирного масла его компоненты были представлены главным образом окисленными продуктами, затем фракция углеводородов превышало кислородсодержащую

Хмель и хмелепродукты следует хранить в сухом, темном и охлажденном помещении с температурой от 0 до 2 °С и относительной влажностью воздуха не выше 70 %.(В.М. Бондаренко, 1959).

Ферментные препараты. Используют при применении более 20 % несоложеного сырья в количестве от 0,001 до 0,075 % к массе перерабатываемого сырья.

Применяют амилолитические (Амилосубтилин Г10х, Амилоризин Пх и др.), протеолитические (Протосубтилин Г10х), цитолитические Цитороземин П10х.

Целлоконингин П10х и др. ферментные препараты, а также их смеси в виде мультиэнзимных композиций.

Амилолитические препараты применяют при затирании при повышенном количестве несоложеного сырья и низком качестве исходного сусла. Они существенно повышают выход экстракта и улучшают качество сусла.

Протосубтилин Г10х используют при повышенных количествах несоложеного сырья и для улучшения качества сусла из некачественных солодов, а также для ликвидации коллоидных помутнений в пиве.

Цитолитические препараты повышают выход экстракта за счет гидролиза некрахмальных полисахаридов, в основном гемицеллюлозы. Одновременно повышаются качество сусла и стойкость пива.

Наиболее перспективным средством является применение мультиэнзимных композиций (МЭК), которые, позволяют сохранить высокое качество «Жигулевского» пива при использовании до 60 % несоложеного сырья.

Дубильные вещества хмеля, относящиеся к группе катехинов, обусловливают терпкость вкуса сусла, его прозрачность и интенсивность окраски.

Эфирное масло хмеля, представленное смесью ароматических углеводородов и терпенов, играет определенную роль в образовании аромата пива, несмотря на то, что в процессе кипячения сусла большая часть эфирного масла улетучивается.

Для улучшения качества пива и полного использования экстрактивных веществ хмеля разработана технология производства молотого брикетированного хмеля, позволяющая уменьшить расход хмеля на 15%. Применяют так же и хмелевые экстракты в соотношении 1:1. (В.М. Бондаренко, 1959).

3 Выделение чистой культуры дрожжевых грибов

В зависимости от программы исследований выбирают тот или иной метод отбора образцов, позволяющий либо только обнаружить и количественно учесть дрожжевые организмы в анализируемом субстрате, либо обнаружить для накопления их биомассы. В разных областях научных исследований и каждой отрасли промышленности имеются свои указания относительно деталей правильного отбора проб для микробиологического анализа. (И.П. Бабьева, В.И. Голубев, 1979).

Поверхность твердого тела. Ее исследуют путем получения смыва, отпечатка или соскоба.

Смыв производят стерильной водой непосредственно с объекта, помещая его в сосуд или же при больших размерах объекта пользуясь ватными или марлевыми тампонами. Такие тампоны затем опускают в суспензионную жидкость, встряхивают и делают высев. Недостатки этого метода заключаются в том, что его, во первых, трудно стандартизовать (разные люди прикладывают разные усилия при смыве ) и во вторых, вата активно сорбирует клетки микроорганизмов и суспензия получается обедненной. Для количественного учета эта техника непригодна. Несмотря на указанные недостатки ,различные методы смыва остаются на более распространенными в области медицинской и санитарной микробиологии, а также при изучении эпифитной флоры зеленых растений. В последнем случае используют непосредственный смыв без тампонов путем нанесения целых листьев или их частей в колбы с водой. При сравнительных исследованиях из листа вырезают пластинки стандартной площади, чтобы можно было сделать пересчет числа микроорганизмов на 1см 2 . листья или вырезанные из них пластинки встряхивают в колбе с водой 10 минут на качалке, а затем делают. (В.Г. Бабицкая, И.В. Стахеев 1977).

Растирание материала, которое иногда рекомендуют, не всегда желательно, так как при этом освобождаются токсические вещества, фитонциды, которые могут оказать губительное действие на микробные клетки.

Метод смыва с поверхностей применяют при исследовании таких объектов, как плоды и овощи, зерно и сметана, мясо и шкуры и тому подобное, а также с оборудования. (В.А. Быков и др. 1987).

Соскоб производят стерильным скальпелем непосредственно в сосуд со стерильной водой. Суспензию перед посевом либо встряхивают 10 минут, либо обрабатывают 5 минут на микроразмельчителе тканей.

Отпечатки приготовляют прямыми или опосредованными методами.

Прямые методы основаны на снятии дрожжевых клеток с исследуемой поверхности различными прозрачными адгезивными материалами: Коллодиевой пленкой бесцветным лаком, липкой целлофановой лентой, полиэтиленовой пленкой, смазанной клеящим веществом. Полученные отпечатки просматривают под микроскопом опуская пленки в капли воды или лактофенола на предметном стекле. (В.Г. Бабицкая, И.В. Стахеев 1977).

Липкой лентой можно снимать и предварительно нанесенную на поверхность объекта тонкую агаровую пленку. Полоску ленты с агаром и прикрепившимися к нему дрожжевыми клетками, рассматривают затем под микроскопом без проращивания. Методы получения отпечатков имеют некоторые общие недостатки: далеко не все клетки снимаются с исследуемой поверхности; при густой обсемененности клетки могут располагаться слишком близко друг от друга и их трудно учитывать. При получении отпечатка с последующим проращиванием исследуемый объект прижимают к поверхности плотной питательной среды, а затем его удаляют, и чашки со средой ставят в термостат. Таким образом удается хорошо наблюдать плотность заселения и характер распределения дрожжей на поверхности листовой пластинки. Если объект большого размера, то поступают наоборот: к нему прижимают приготовленную среду, пользуясь методом агаровой колбаски. Колбаски делают из разных питательных агаров, запечатывая их стерильно в пергаментную обертку. Срезая последовательно круглые ломтики, их 4 размещают в стерильные чашки Петри и проращивают во влажной камере. (И.П. Бабьева и В.И. Голубев1987).

Отпечатки можно получать с помощью мягких пластичных материалов, таких как бархат, замша, вельвет из которых делают круглые подушки - репликаторы. Лучше всего использовать - бархат велюр, белый или бледно желтый (другие краски могут быть токсичны).Бархат первоначально кипятят, режут круглые куски и приклеивают их к алюминиевым дискам такого размера чтобы они помещались в чашку Петри. (А.Ю. Жвиблянская, В.С. Исаева, 1979).

Стерилизую завернутыми в бумагу сухим жаром при 160оС 1 ч. Перед использованием поверхность бархата смачивают жидкой питательной средой и прикладывают его к исследуемому объекту на несколько секунд. Затем не сдвигая! Осторожно отнимаю и переносят в чашку Петри. Отпечатки делают на серии чашек с одной или разными средами. После употребления репликаторы стерилизуют в сосудах с водой автоклавированием 20 мин при 120оС, подсушивают и расправляют бархат шпателем. Особенно удобно пользоваться мягкими репликаторами при работе с неровными и шероховатыми поверхностями.

Сыпучие и плотные субстраты. Их берут для анализа в стерильные пергаментные пакеты. Влажные пробы отбирают в стерильные стеклянные банки или новые полиэтиленовые пакеты. Отбор проб ила со дна водоемов производят статометром, или дночерпателем. В других случаях пробы можно брать специальной ложкой, ножем или шпателем, которые предварительно протирают спиртом и обжигают. (С.А. Коновалов, 1962).

При сборе образцов почв для экологического исследования соблюдают специальные правила, гарантирующие репрезентативной выборки.

Прозрачные жидкости и взвеси. Присутствие дрожжей в них можно установить непосредственно под микроскопом или после концентрирования на центрифугах при частоте вращения 2000 об/мин в течении 15-20 мин.

Пробу воды и жидкостей отбирают в стерильные сосуды. Воду из природных водоемов берут специальными приборами-батометрами. Из них воду фильтруют через мембранные фильтры с порами диаметром 1,2 мкм. Далее фильтры либо помещают на поверхность питательных сред для проращивания клеток дрожжей, либо окрашивают и наблюдают под микроскопом. Можно брать два фильтра: один для проращивания и окраски, а другой (нижний) для контроля на пропускание.

Масла и эмульсии, включая сливочное масло и мороженое, можно также исследовать методом мембранных фильтров после обработки их эмульгаторами. Жидкости и взвеси необходимо анализировать вскоре после отбора проб, а при невозможности этого хранить в холодильнике не более 1-2 сут, так как далее первоначальное количество дрожжей в них может существенно измениться. (М.И. Ратнер и Каннель Э.С.).

Воздух. Методы анализа воздуха основаны либо на осаждении аэрозолей, либо на фильтрации его через жидкости или твердые фильтры.

Метод Коха основывается на свободном оседании микробных аэрозолей на поверхность питательной среды под влиянием гравитационных сил. Чашки со средой оставляют открытыми на 5-15 мин, а затем закрывают и помещают в термостат. Этот метод используют для обнаружения дрожжей в воздухе закрытых помещений при кратковременной экспозиции чашек. В открытых местах его использованию мешают горизонтальные потоки воздуха.

Все другие методы определения микроорганизмов в воздухе основан на принудительном его токе, который создается разными способами.

Для санитарно-микологического контроля окружающей среды на предприятиях по производству белково-витаминных препаратов и кормовых дрожжей количественный учет дрожжей – продуцентов рода Сandida рекомендуется проводить щелевым методом на сусло-агаре и МБС – метабисульфитном агаре (МПА + 0,2% метабисульфита натрия ) с добавлением биомицина в количестве 100000 ед/л. Рост продолжается 48ч при 37°.(С Фениксова Р.В. 1973).

Для фильтрации воздуха через жидкости используют прибор Киктенко, основанный на осаждении микробных клеток в улавливающей жидкости, которую затем переносят по 0,1 – 0,3 мл на плотную среду и проращивают.

Общий принцип посевов заключается в том, что образец превращают в такое состояние, когда он может быть серийно разведен, чтобы сделать из него высев или сразу в чашки, или перевести клетки сначала на мембранные фильтры. (Коновалов С.А. 1962)

В качестве суспензионных жидкостей используют стерильную водопроводную воду, в которую иногда добавляют поверхностно-активные вещества (например, Твин-80, 1капля на 0,5 л), 0,5%-ный раствор NaCl в дистиллированной воде (при выделении психрофильных дрожжей).

Высев на плотные питательные среды из подготовленной суспензии делают пипеткой, внося в каждую чашку по 0,5 мл или по одной капле измеренного объема. Чашек берут всегда не менее трех для каждого разведения, чтобы получить среднее число колоний на одной чашке.

После посева чашки инкубируют 24 ч в обычном положении, чтобы агар адсорбировал жидкость, а за тем перевертывают во избежание попадания на поверхность капель конденсата с крышки.

При инкубировании посевов большое значение имеет поддержание определенной температуры. Преобладающее число видов дрожжей относится к группе мезофильных микроорганизмов с температурными границами роста от 2 – 5 до 30 – 37°С и оптимумом при 26 – 28°С. Среди дрожжей нет истинных термофилов, для роста которых требуются температуры выше 50°С. При выращивании дрожжей при температуре 40 – 45°С необходимо добавлять в среду олеиновую кислоту.( Жвирблянская А.Ю., Исаева В.С.)

Подбор температурных условий при выделении дрожжей зависит от источника выделения и целей исследования. Из теплокровных животных и из различных органов человека и связанных с ним субстратов дрожжи выделяют при 37°С, если хотят найти патогенные формы, и при 28°С в случае поиска сапрофитных видов. Если дрожжи растут при 37°С, то требуется соблюдать осторожность, так как среди них могут быть патогенные – Cryptococcus neoformans или Candida albicans (=Syringospora albicans).

Посевы из материала, где предполагается наличие психрофильных дрожжей, инкубируют в холодильнике при температуре 4 – 5°С.( Коновалов С.А. 1967).

Сроки инкубирования непосредственно зависят от температуры. При 37°С инкубируют не более 4, а в холодильнике не менее 14 сут. Если дрожжи дают визуально заметный рост при 4 – 5°С в течение 7 – 10 дней, то их относят к истинным психрофилам при условии, что выше 20°С они не растут. Температурный оптимум таких дрожжей находится обычно в диапазоне от 10 до 15°С. Психротолерантные дрожжи вырастают при 5°С в течение 2 – 3 недель, а психрофобные при температуре ниже 30°С не растут совсем. В посевах из почвы, инкубируемых при низких температурах, удается учесть в 2 – 3 раза больше дрожжей, чем при 28°С, так как росту дрожжевых колоний при этом не мешают грибы с быстро распространяющимся мицелием. Учет опытов в этих случаях следует производить дважды – через две недели и через месяц.

Стандартные полноценные питательные среды. Эти среды применяют с целью наиболее полного учета и выделения большинства видов дрожжей. Наиболее широко используемой полноценной средой для выращивания дрожжей является солодовое сусло. В его состав входят глюкоза, фруктоза, сахароза, мальтоза, мальтотриоза и мальтотетраоза, а также небольшое количество пентоз – арабиноза, ксилоза и рибоза. Азотные компоненты составляют 6 – 7% сухих веществ (СВ), среди них аммонийного азота 2,18 – 2,44 мг на 100 мл. В сусле имеются аминокислоты, все основные витамины группы В и минеральные вещества, содержание которых зависит от используемой воды.( Бабьева И.П., Голубев В. И.).

Сусло получают с пивоваренных заводов неохмеленное, после фильтрации. Его разводят водопроводной водой до концентрации 6 – 8% СВ.

Для приготовления сусла в лаборатории используют ячменный солод крупного помола с высокой осахаривающей способностью. В 1 л воды вносят 250 г солода и нагревают до 50°С. Через 30 мин постепенно поднимают до 62,5 – 63°С и не снижают до исчезновения реакции на крахмал (йодная проба). Полученное сусло отделяют от дробины путем фильтрации через марлю и вату, разбавляют водой до нужной концентрации, разливают по колбам и стерилизуют при 112°С 30 мин. Если рН ниже 5,5, то сусло подщелачивают 10%-ным раствором соды или едкого кали до получения рН 5,6 – 6,0. Сусло очищают от примесей кизельгуром или отстаиванием в холодильнике с фильтрацией. Для приготовления плотных сред к суслу перед стерилизацией добавляют 2% агара или 20% желатины.( Быков В. А.).

Сусло-агар можно приготовить из сухого солодового экстракта, 20 г порошка растворяют в 400 мл горячей дистиллированной воды, содержащей 12 г агара, и стерилизуют при 121°С 15 мин.

Из синтетических сред наиболее часто для дрожжей используют агар Сабуро, называемый также глюкозо-пептонной средой, со следующим составом(в г на 1 л водопроводной воды): глюкоза 40, пептон 10, агар 20.

Глюкозо-аммонийная среда содержит (в г на 1 л водопроводной воды) следующие вещества: Глюкоза − 20,0; (NH4) 2SO4 − 5,0; KH2PO4 − 0,85; K2HPO4 − 0,15; MgSO4 − 0,5; NaCl − 0,1; CaCl2 − 0,1; Агар − 20,0;

Для обогащения факторами роста к этим средам добавляют иногда дрожжевой (0,2%) и мясной (0,3%) экстракты и виноградный сок (3%).

Дифференциальные среды. Их используют при выделении дрожжей из субстратов, сильно загрязненных другими микроорганизмами. Для подавления роста сопутствующих микроорганизмов к указанным выше питательным средам добавляют различные ингибиторы. Рост большинства бактерий и актиномицетов подавляется при низком значении рН среды, поэтому чаще всего среды для выделения дрожжей подкисляют до рН 4,5 путем добавления к ним органических кислот. Для синтетических сред наиболее применима соляная кислота, для сусловых молочная, лимонная или винная. Для подкисления заводского солодового сусла (6 – 8% СВ) обычно требуется 3 – 4 мл/л концентрированной молочной кислоты. Кислоты добавляют в жидкую или расплавленную агаровую среду после стерилизации, непосредственно перед засевом или перед разливкой в чашки Петри. Все дрожжи, кроме Schisosaccharomyces pombe (рН 5,45), растут при рН до 2,5. Если брать 3% агара, то среда застывает при рН 4,8. (Градова Н. Б).

Вместо кислот используют также антибиотики широкого спектра действия: стрептомицин (80мг/л или 100 ел/мл), пенициллин (20-100 ед/мл), левомицетин (50 мг/л) и др. Их можно добавлять в среду порознь и в комплексе. Например, против кислотоустойчивых бактерий применяют следующие смеси антибиотиков: актиномицин 2 мг/л +ауреомицин 50 мг/л; пенициллин 60 ед/мл +стрептомицин 100 ед/мл; левомицетин (хлорамфеникол) 20 мг/л +строптомицинсульфат 20 мг/л +хлортетрациклин солянокислый 100 мг/л.

Страницы: 1, 2, 3