Выделение, изучение свойств микроорганизмов и их использование для выполнения подготовительных процессов переработки овчинно-мехового сырья

Выделение, изучение свойств микроорганизмов и их использование для выполнения подготовительных процессов переработки овчинно-мехового сырья

Содержимое второго ряда воронок взбалтывают в течении 2 минут и после расслоения спускают хлороформный слой в мерные колбы вместимостью 50 см3 через воронки с кусочками ваты для отделения возможно образовавшейся мути. В делительные воронки наливают еще по 5 см3 хлороформа, взбалтывают 2 минуты и после расслоения спускют хлороформ в мерные колбы. Эту операцию повторяют еще раз. Объем экстракта в мерных колбах доводят до метки хлороформом, перемешивают и определяют оптическую плотность окрашенных растворов на фотоколориметре с красным светофильтром (l=650 нм) в кюветах с толщиной поглощающего слоя 20 мм.

При определении содержания анионактивного СПАВ в сточной воде 100 см3 хорошо перемешанной сточной воды помещают в делительную воронку. Если объем пробы меньше 100 см3 его доводят до 100 см3 дистиллированной водой. В делительную воронку вливают 10 см3 фосфатно-буферного раствора, 5 см3 нейтрального раствора метиленового голубого, 15 см3 хлороформа и далее все операции проводят, указанные при построении калибровочного графика.

Параллельно проводят холостой опыт со 100 см3 дистиллированной воды.

Если оптическая плотность превышает максимальное значение калибровочного графика, то отбирают аликвотную часть хлороформного экстракта и разбавляют хлороформом. Таким же образом разбавляют и раствор холостого опыта.

Калибровочный график представлен на рис. 2.

Содержание анионактивных СПАВ определяют по формуле (4):

С´1000

Х= –, (4)

V

где Х-содержание аниононактивных СПАВ, мг/см3;

С-содержание СПАВ, найденное по калибровочному графику, мг;

V – объем сточной воды, взятый для анализа, см3;

1000-перевод в дм3.

Неионогенный СПАВ реагирует с роданокобальтом аммония, образуя комплексные вещества синей окраски, растворимые в хлороформе, роданокобальтата аммония в хлороформе нерастворим. Чувствительность реакции невелика, но поскольку определяемые вещества нелетучи, возможно предварительное концентрарование путем выпаривания анализируемой воды досуха и растворением остатка в спирте и воде.

Приготовление стандартного раствора: 1 г применяемого неионогенного СПАВ растворяют в дистиллированной воде и доводят объем до 500 см3.

Построение калибровочного графика: отбирают 0; 0,5; 1; 2; 3; 4 и 5 cм3 стандартного раствора, доводят объем до 5 см3 и переносят в ряд делительных воронок вместимостью 50 см3, в которые предварительно налито по 20 см3 раствора роданокобальтата аммония. Содержимое воронки взбалтывают 1 минуту и дают постоять 5 минут. Затем прибавляют 4 см3 хлороформа, взбалтывают 1 минут и оставляют до расслаивания жидкости. Слой хлороформа сливают через воронку, в которую предварительно вкладывают кусочек ваты, пропитанный хлороформом, в калибровочную пробирку вместимостью 10 см3. Извлечение окрашенного комплекса повторяют дважды, используя порции хлороформа объемом 4 и 2 см3 и, собирая хлороформные экстракты в ту же пробирку. Пробирку опускают на 5 минут в водяную баню при температуре 200С и, если надо, доливают хлороформ до метки и перемешивают.

Оптические плотности полученных хлороформных экстрактов определяют на фотоколориметре с оранжевым светофильтром (l=610 нм) в кюветах с толщиной поглощающего слоя 30 мм. По полученным данным строят калибровочный график зависимости оптической плотности от содержания неионогенного СПАВ.

Калибровочный график представлен на рис. 3.

Содержание неионогенного СПАВ определяют по формуле (5):

С´1000

Х= –, (5)

V

где Х-содержание неиногенного СПАВ, мг/дм3;

С-содержание неионогенного вещества, найденное по калибровочному графику, мг;

V – объем сточной воды, взятый для анализа (с учетом разбавления или упаривания), см3;

1000-перевод в дм3.

2.2.13 Определение рН жидкости

Для измерения рН жидкости используется цифровой ионометр И-120.2. Входное напряжение прибора 220 В, частота 50 Гц. Ионометр предназначен для измерения рН жидкой фазы, температуры, С, градиента, %.

Измерение рН проводили следующим образом: химический стакан на 50 мл наливали 35 мл жидкости исследуемого раствора, погружали электроды, снимали показания. После этого промывали дистиллированной водой и протирали фильтровальной бумагой.

2.2.14 Качественный анализ вещества по ИК-спектрам поглощения

При измерении ИК-спектра твердого вещества работа ведется в следующей последовательности:

– из предварительно высушенного вещества (3–5 мг) готовят суспензию в виде пасты (растирают вещество с несколькими каплями вазелинового масла);

– количественно переносят на нижнюю крышку кюветы. Кювету закрывают в держателе и устанавливают в канале спектрофотометра. Записывают спектральные вещества в диапазоне от 4200 до 1200 см-1.

2.2.15 Отбор проб методом асимметрической бахромы

Для сопоставимости результатов исследований различных факторов или технологических параметров необходимо исключить влияние топографии шкуры, полуфабриката или кожи. В этом случае для отбора средней пробы пользуются методом ассиметрической бахромы (МАБ), который заключается в следующем. Намечают необходимое число вариантов исследования и задаются числом образцов (полосок), входящих в группу, предназначаемую для каждого варианта (обычно не менее 4). Чем больше число образцов, тем более достоверным будет среднее значение, характеризующее вариант. Размер образца предопределяется набором физико-механических или физических испытаний, которые предполагается провести, а все образцы должны уложиться в прямоугольник, вписанный в чепрачную часть (рис. 4).

Отбор проб методом асимметрической бахромы

Рис. 4

2.2.16 Определение содержания несвязанных жировых веществ в волосяном покрове и кожевой ткани

ГОСТ 26129–84. Шкурки меховые и овчина шубная выделанные. Метод определения содержания несвязанных жировых веществ.

Навеску измельченной кожевой ткани или волоса массой 0,5–1,5 г, взвешенную с погрешностью не более 0,0002 г., помещают в бумажную или стеклянную гильзу и закрывают тампоном. Гильзу закрепляют в предварительно доведенной до постоянной массы колбе и соединяют колбу с холодильником. Через воронку с ватным тампоном, помещенную в верхнее отверстие холодильника заливают 50 см3 дихлорэтана или хлороформа, нижняя часть гильзы должна быть не расстоянии не менее 10 мм от поверхности растворителя. Колбу с растворителем нагревают на электроплитке с асбестовым покрытием или песчаной бане. Продолжительность экстрагирования при анализе кожевой ткани – 45 мин., при анализе волоса – 15–20 мин. Растворитель должен постоянно кипеть и, охлаждая и стекая с холодильника, попадать в центр гильзы. Растворитель отгоняют холодильника, попадать в центр гильзы. Растворитель отгоняют и колбу с жировыми веществами доводят до постоянной массы в сушильном шкафу при температуре 128–1300С. Продолжительность 1-ой сушки – 30 мин., последних по 15 мин.

При определении несвязанных жировых веществ гравиметрическим методом массовую долю жировых веществ (Х) в% вычисляют по формуле (6):

                   m-m1

Х=     – ´ 100, (6)

                   m2

где Х – массовая доля жировых веществ, %;

m – масса колбы с экстрагированными жировыми веществами, г;

m1 – масса пустой колбы, г;

m2 – масса навески кожевой ткани или волоса, г.

2.2.17 Определение прочности связи волоса с кожевой тканью

Образец размером 100´25 мм, вырезанный из огузочной части овчины, отмывают в проточной воде, отжимают и разрезают на ремешки размером 25´10 мм. В середине ремешка ограничивают полоску волоса, равную 5 мм. Это достигается путем применения специальной вилки с двумя параллельными иглами, находящимися на расстоянии 5 мм. Вилку вдвигают в волосяной покров как можно ближе к кожевой ткани и ограничивают полоску волоса шириной 5 мм. Перед испытанием ремешки выдерживают в воде при комнатной температуре с добавлением кальцинированной соды из расчета 5 г/дм3. После обводнения образца удаляют избыток влаги фильтровальной бумагой и приступают к испытанию.

2.2.18 Определение показателя белизны волосяного покрова меховой овчины

Показатель белизны волосяного покрова определяют на спектроколориметре «Пульсар». Для проверки работоспособности прибора необходимо:

1) включить прибор и нажать кнопку «СБРОС», на дисплее прибора высветятся символы «Ч» и «С», на индикаторах режима и вывода – «0»,

2) нажать на кнопку «ПУСК», через 10 с на левом и среднем индикаторах дисплея высветятся символы «Б» и «С» соответственно,

3) нажать на кнопку «ПУСК», через 10 с на левом индикаторе дисплея символ «Б» заменится на «I», соответствии индикации на дисплее прибора значениям индикатора проверяется по таблице.

Для смены значения цифр на индикаторе режима необходимо нажать на кнопку «УСТ.РЕЖИМА».

4) Перед измерениями прибор необходимо прогреть в течение 30 минут.

Порядок измерения:

1) Установить на индикаторе режима цифру «2», на индикаторе вывода цифру «3».

2) Установить на место установки отражающего образца измеряемый образец и запустить прибор.

3) По окончании измерения на индикаторах дисплея высветятся значения координат цветности, Х, Y и яркость измеряемого образца.

2.2.19 Определение токсичности сточных вод

В качестве тест-объектов можно использовать следующие организмы: дафнии (Daphnia magna Straus); большой прудовик (Limnaca stagnalis) и гуппи (Lebistes reticulatus). Установление уровня токсического загрязнения (УТЗ) водных масс по данным биотестирования на дафниях представлены в табл. 2.

Таблица 2. Установление УТЗ водных масс по данным биотестирования на дафниях

К первому классу – весьма остротоксичному – относится вода, если все организмы погибают в ней в течение суток или менее; ко 2 классу – вода остро токсична, все организмы погибают в течение пяти суток; к 3 классу – токсичному, если в течение пяти суток гибель дафний достигает 70–100%; к 4 классу – мало токсичному, если гибель дафний не превышает 30%; к 5 классу – условно нетоксичному, если по истечении 5 суток все организмы выживают и по внешнему состоянию или поведению не отличаются от контрольных.

Выполнение работы. В сосуд с очищенной исследуемой жидкостью запускают тест-объект и проводят визуальную оценку его физического состояния в течение 5 суток. На основании полученных результатов проводится оценка токсичности воды. В качестве критерия токсичности используется параметр выживаемости тест-объекта.

2.2.20 Обработка результатов эксперимента

Обработка результатов эксперимента производилась по программе «OTSEV-12». Этот метод основан на рассмотрении стандартного отклонения. По программе можно обрабатывать результаты эксперимента при количестве данных от 3 до 20. Это обусловлено тем, что в подпрограммах приведены табличные значения критерия Стьюдента от 3 до 20. В программе используются табличные значения критерия Стьюдента. В программе возможна проверка грубых ошибок только двух значений (максимального и минимального). Расчет по программе «OTSEV-12» производится по формулам, приведенным ниже.

Среднеквадратичное отклонение определяют по формуле (7):

                             (å хi2) – [(åxi)2 / N]

s =              ––––––––––––––, (7)

                                       N – 1

где s – среднеквадратичное отклонение;

хi – измеренная величина;

N – количество параллельных опытов.

Коэффициент вариации определяется по формуле (8):

                   s

Кв = –––––––––– ´ 100, (8)

                   х

где Кв – коэффициент вариации, %;

s – среднеквадратичное отклонение;

х – среднее арифметическое значение.

Относительная погрешность определяется по формуле (9):

Е = Е1 – Е2, (9)

где Е – относительная погрешность, %;

Е1 – систематические погрешности измерений, %;

Е2 – случайные погрешности измерений, %.

Относительная ошибка измерения определяется по формуле (10):

                   s0 ´ tт

D = –––––––––, (10)

                   Х

где D – относительная погрешность, %;

s0 – стандартное отклонение среднего;

Е – погрешность измерения, %;

tт – табличное значение коэффициента (критерия) Стъюдента.

Доверительный интервал определяется по формуле (11):

m = s0 ´ tт (11)

где m – доверительный интервал;

s0 – стандартное отклонение среднего;

tт – табличное значение коэффициента (критерия) Стъюдента.

3. Экспериментальная часть

Одной из важных проблем мехового производства является снижение загрязнения сточных вод синтетическими поверхностно-активными веществами. Поступая в нативные водные объекты, СПАВ изменяют кислородный режим вод, вызывая гибель организмов. Решение этой проблемы особенно актуально в Байкальском регионе.

В настоящее время наиболее перспективным является использование биотехнологических методов, основанных на применении микроорганизмов с заданными свойствами, что позволяет уменьшить уровень техногенного воздействия на окружающую среду.

Высокая степень загрязнения сточных вод после процесса обезжиривания меховой овчины объясняется высокой начальной концентрацией СПАВ – 8 г/дм3 и формальдегида, являющегося токсичным и для человека, и для гидробионтов.

Одним из способов, позволяющих снизить уровень токсического загрязнения сточных вод, является совершенствование технологического процесса путем разработки новых обезжиривающих составов, позволяющих решить данную проблему при сохранении качества готовой продукции.

В связи с этим целью данной работы являлась разработка условий проведения совмещенного эмульсионного и микробиологического обезжиривания, основанного на применении концентрированного ферментного препарата, продуцируемого культурами рода Listeria. Исследуемые культуры были выделены из сточных вод после эмульсионного обезжиривания меховой овчины. Для получения ферментного препарата проведена его адаптация на синтетических средах, где в качестве единственного источника углерода были использованы синтетические поверхностно-активные вещества. В синтетическую среду вводили СПАВ различной химической природы: анионактивные – Гамма, De-sol-A, неионогенные – Превоцелл W-OF-7, Wetter HAC.

3.1 Изучение морфолого-физиологических и культуральных свойств микроорганизмов

Целью данного этапа эксперимента являлось выделение, изучение свойств микроорганизмов и определение их видовой принадлежности. Исследуемые культуры были выделены из сточной воды после эмульсионного обезжиривания меховой овчины. Изучаемые культуры были обозначены номерами 3,7, F, G, I, I¢. Получение чистых культур прокариотических микроорганизмов проводили путем изолирования отдельных клеток на плотной питательной среде, используя метод посева штрихом и метод разведения. Для получения чистых культур методом посева штриха, петлей с культурой зигзагом наносили на поверхность среды. Синтетическую среду готовили в соответствии с п. 2.2.1. с иcпользованием в качестве источника углерода СПАВ «Превоцелл-W-OF-7» в количестве 1 г/л. Для получения единичных колоний методом разведения в чашки Петри вносили 0,1 см3 разведенной культуры и равномерно распределяли с помощью стеклянного шпателя по всей поверхности. Чашки Петри с культурами инкубировали в перевернутом виде в термостате в течение 24 ч при постоянной температуре (38±0,5)0С.

В ходе эксперимента готовили синтетические среды с содержанием импортного и отечественного агар-агара в соотношении 1:1 и 1,5:0,5. Агар-агар отечественного производства содержит большое количество органической примеси, которая служит дополнительным источником питания микроорганизмов, а в импортном – практически отсутствуют. Для восстановления жизненно важных функций и определения морфолого-физиологических свойств микроорганизмов методом 10-ти кратного разведения культуры пересевали на чашки Петри, где в качестве питательной среды использовали мясопептонный агар (МПА).

Синтетические среды с содержанием 1:1 и 1,5:0,5 импортного и отечественного агар-агара обозначили буквами В и С соответственно, а мясопептонный бульон-А. Изменение культуральных свойств в зависимости от вида питательной среды представлено в табл. 3.

Как видно из данных, представленных в табл. 3, с изменением состава синтетической среды (с В на С) колоний практически не изменяется и колеблется от белого до желтоватого. Форма колоний – круглая, но с уменьшением содержания органической примеси у культур I и I’ форма оставалась без изменений, но с валиком по краям и фестончатым краем соответственно. Профиль и поверхность колоний не менялись. У культур I и I’ размеры переходят от точечных до средней величины. А также структура колоний I’ переходит из однородной (среда В) в мелкозернистую (среда С).

На МПА культуры имели, в основном, круглую форму, но с разнообразными краями – гладкими (колонии 3, F, G) и ворсистыми (7, I, I’). Поверхность выросшие культуры имели гладкую, за исключением F, I (шероховатая). Все колонии имели точечные размеры (диаметр менее 1 мм), кроме I (средней величины d>1 мм). Цвет изменяется от белого до желтого. Структура колоний 3,7, G была однородной, а у культур F, I, I’ – мелкозернистой. Из табл. 3 видно, что с изменением соотношения агар-агара импортного и отечественного производства lg КОЕ снижается. Так, например, для культуры 3 данный показатель уменьшается с 7,62 до 6,48. На среде МПА максимальный lg КОЕ наблюдается у культуры 3 (27,82), а минимальный – у I’ (18,04).

Далее определяли такие морфолого-физиологические признаки микроорганизмов, как спорообразование, подвижность, разжижение желатина, наличие сероводорода, аммиака, каталазы, а также редуцирующую способность. Данные определений представлены в табл. 4.

Далее провели исследования колоний на тинкториальную способность (окраска по Граму и подвижность). Окраска по Граму является дифференциально-диагностической и зависит от содержания в клеточной стенке гликолипида муреина, представляющего собой гетерополимер, который в свою очередь состоит из чередующихся остатков N-ацетилглюкозоамина и N – ацетилмурамовой кислоты и пептидов. Грамположительная окраска указывает на наличие небольшого количества полисахаридов, липидов и белков и характерна для всех выделенных культур. Исследование подвижности показало, что для микроорганизмов типа 3,7, I характерен лофотрихиальный тип движения, культуре F – перетрихиальный, G – монотрихиальный. А для культуры I’ характерен как монотрихиальный, так и лофотрихиальный тип движения.

Протеолитические свойства микроорганизмов изучали посевом в мясопептонный желатин (МПЖ) согласно п. 2.2.5. Выделенные культуры, кроме F, обладают протеолитическими свойствами, т. к. разжижают МПЖ. Для обнаружения сероводорода делали посев уколом пристеночно в агар-агар с уксуснокислым свинцом (п. 2.2.5.1.). Если культура при разложении белка выделяет сероводород, то появляется темно-бурое окрашивание (почернение) по месту укола в плотной среде. Культуры 3, F, I выделяют сероводород, а остальные – нет. Ни одна культура не выделяет аммиак, определение которого проводили в соответствии с п. 2.2.5.2. при наличии фермента каталазы при действии перекиси водорода обнаруживают обильное выделение пузырьков отщепленного кислорода, т.е. образуется «пенистая шапка». Каталаза присутствует во всех выделенных культурах. Редуцирующей способностью (обесцвечивание молока с метиленовым синим) обладают все культуры, за исключением I.

На основе исследования свойств микроорганизмов определили их видовую принадлежность /53/. Бактерии рода Listeria представляют собой короткие палочки правильной формы с закругленными краями. Грамположительные, неспорообразующие, каталазоположительные. Следовательно, культуры 3, 7, G, I’ можно отнести к данному роду, т. к. они имели форму коротких палочек, окрасились в фиолетовый цвет (грамположительные) и не образовывали при определении каталазы «пенистую шапку». Данные микроорганизмы широко распространены в окружающей среде, некоторые виды патогенны для человека и животных.

Культуру F можно отнести к роду Brochotrix. Данные микроорганизмы имеют палочки правильной формы в цепочках, грамположительные и каталазоположительные. Эти признаки наблюдались при изучении свойств культуры F. Данные организмы широко распространены в природе.

Бактерии рода Bacillus имеют форму прямых палочек с закругленными концами, грамположительные, подвижные и образующие овальные эндоспоры, каталазоположительные. Как видно из данных табл. 4, все эти признаки относятся к культуре I. Данные микроорганизмы обнаруживаются в разнообразных местообитаниях, некоторые виды патогенны для позвоночных и беспозвоночных.

Липолитические свойства микроорганизмов определяли посевом в бульон Штерна, где в качестве единственного источника углерода использовали оливковое масло с концентрацией 1 см3/100 см3 бульона. Бактерии, обладающие липолитическими свойствами, при ферментации оливкового масла извлекают из него альдегиды, подкисляя среду, при этом окраска бульона переходит из золотисто-желтой в розовую. Стерильный бульон Штерна разливали в пробирки по 10 см3 в каждую и вносили исследуемые культуры. Пробирки с микроорганизмами термостатировали при температуре (38±0,5)0С. В течение 120 ч проводили визуальные наблюдения за изменением физических свойств бульона Штерна, которые выражались в образовании хлопьев, а также в изменении цвета и прозрачности. В качестве контрольного варианта использовали состав, включающий в себя бульон Штерна без введения микроорганизмов. Результаты наблюдений представлены в табл. 5.

Таблица 5. Влияние типов бактерий на свойства бульона Штерна

Как видно из данных, представленных в табл. 5, практически для всех типов микроорганизмов в процессе культивирования не наблюдалось образование хлопьевидного осадка, за исключением культур 7, G. Для них характерно появление хлопков вследствие продуцирования экзоферментов в последние 72–120 ч. Использование оливкового масла бактериями в качестве источника энергии и углерода подтверждалось переходом окраски из золотисто-желтой в розовую, за счет образования в результате деструкции жировых веществ, альдегидов и жирных кислот, что вело к понижению величины рН. Данная зависимость наблюдалась для культур I¢, 7, G через 72–96 ч культивирования. Изменение прозрачности бульона, в основном, через 48 ч у всех культур, кроме контрольного варианта, свидетельствовало об интенсивном росте и развитии микроорганизмов.

Таким образом, в результате проведения данной части дипломной работы были исследованы морфолого-физиологические и культуральные свойства микроорганизмов и определена их видовая принадлежность. Так культуры 3,7, I¢ относятся к роду Listeria, F- к роду Brochotrix, I – к Bacillus.

3.2 Влияние условий культивирования на свойства ферментного препарат а, продуцируемого культурой рода Listeria

Целью второго этапа эксперимента являлось определение оптимального времени культивирования для получения ферментного препарата с заданными свойствами.

На основании первой серии эксперимента для дальнейшего исследования были выбраны три культуры рода Listeria типа 3, 7, I', а также среды, содержащие следующие виды СПАВ: Превоцелл W-OF-7, Wetter HAC, Гамма и De-sol-A. Для получения биомассы исследуемых культур микроорганизмов, активизированных в первой части, готовили бактериальные суспензии. Для этого каждую выросшую культуру не скошенном агаре переносили в колбы Эрленмейера на 250 см3, содержащие по 200 см3 жидкой синтетической среды, приготовленной в соответствии с п. 2.2.1. Культивирование проводили при (38±0,5)0С при переменном механическом воздействии, осуществляемом на «Shaker Type» с частотой колебания 250 об/мин, с амплитудой 6 по 2 часа в сутки.

Через каждые 24 часа культивирования снимали следующие характеристики: подсчет величины КОЕ (п. 2.2.2), определение рН (п. 2.2.13), кислотности, мутности (п. 2.2.7), а также концентрации анионактивных и неионогенных СПАВ согласно п. 2.2.12.1 и п. 2.2.12.2. Для определения концентрации белка по Ярош, липолитической и протеолитической активностей брали сырую поверхностную культуру, которую получали путем высаливания NH4(SO4)2 из пробы с расходом 30% от объема, согласно п. 2.2.8. Затем отделяли фугат от осадка. Оставшуюся часть (50 мл) выпаривали в фарфоровой чашке и готовили пробу для качественного анализа вещества по ИК-спектрам поглощения в соответствии с п. 2.2.14. Осадок растворяли в 25 мл дистиллированной воды и проводили определение протеолитической, липолитической активностей и концентрации белка. Данные результатов исследования для культур рода Listeria sp 3 приведены в табл. 6, типа 7 – в табл. 7, типа I' – в табл. 8.

Степень вовлечения в конструктивный и энергетический обмен оценивали по изменениям интенсивности по ИК-спектров и концентрации СПАВ.

Как видно из данных, представленных в табл. 6–8 и на рис. величина КОЕ (колонии образующие единицы) для сред с Превоцелл W-OF (культура рода Listeria sp 3, I'), Wetter HAC (3,7, I') начинала увеличиваться с начала культивирования, достигая максимума к 48 ч. Так для среды, содержащей Превоцелл W-OF-7 и культуру Listeria sp 3 lg КОЕ=3,05 и увеличивается до lg КОЕ=4,60. Затем данная величина начинала уменьшаться до lg КОЕ=3,70. Вероятно это можно объяснить тем, что в начале культивирования (0 ч) наблюдалось увеличение числа клеток в результате возрастания частоты клеточного деления, что соответствовало лаг-фазе. Вторая логарифмическая фаза характеризуется постоянной продолжительностью существования возникающих друг за другом клеток. Затем наблюдался переход в стационарную фазу размножения (достижение максимума lg КОЕ). После наступала фаза отмирания, когда биомасса клеток уменьшается за счет автолитических процессов и лимитирования по субстрату для Превоцелл W-OF-7 (культура Listeria sp 3) до lg КОЕ=3,70. Увеличение величины КОЕ также подтверждается возрастанием мутности. Для Превоцелл W-OF-7 (культура типа 3) и Wetter HAC (культура типа 7) мутность повышается с 0,04 до 0,17 и с 0,035 до 0,22 соответственно. Lg КОЕ увеличивается до определенного момента, а затем уменьшается, а мутность постоянно возрастает. Это можно объяснить увеличением концентрации белка с 0 до 1,55 г./дм3 – для среды, содержащей Превоцелл W-OF-7 (культура типа 3) и с 0 до 1,05 г./дм3 – для cреды, содержащей Wetter HAC (культура типа 7).

Для таких СПАВ, как Гамма, De-sol-A и Превоцелл W-OF-7 (культура Listeria sp 7) роста колоний не наблюдалось, но о развитии прокариотических организмов свидетельствует увеличение показателя мутности и концентрации белка. Также был вычислен индекс скорости размножения – µ и время регенерации-g.

Индекс скорости размножения рассчитывали по формуле (12):

                   Ln (N/N0)

µ= –––––––––––––––––––, (12)

                   t

где µ-индекс скорости размножения;

N0 - число клеток в нулевой точке отсчета времени;

N-число клеток в любое, более позднее время;

t – время, ч.

Время регенерации определяли по формуле (13):

                   log N-log N0

g= ––––––––––––––––––, (13)

                   log 2

где g-время регенерации;

N-число клеток в нулевой точке отсчета времени;

N0 – число клеток в любое, более позднее время.

Как видно из данных табл. 6–8, максимальные удельная скорость размножения и время регенерации характерны для состава, содержащего Wetter HAC (культура типа 3), и составляет 0,1341 и 4,65 соответственно при 24 ч культивирования. В основном, после 48 ч культивирования наблюдается снижение данных показателей до отрицательной величины. Это указывает на то, что оптимальным временем культивирования является 48–72 ч. Практически во всех случаях наблюдается увеличение показателей активной реакции среды и кислотности. Увеличение рН, вероятно, связано с тем, что для синтеза аминокислот, которые являются составляющими ферментов, необходим азот. Свободный азот микроорганизмы способны фиксировать из воздуха и прежде, чем такой окисленный элемент станет составной частью аминокислот, он должен быть восстановлен. Восстановление азота до аммиака происходит с участием АТФ, кроме того, в состав сред входит NH4Cl, который также участвует в образовании аминокислот, и образующийся аммиак различными путями включается в состав органических соединений и прежде всего в состав аминокислот. И на этом этапе образования аммиака и происходит увеличение рН.

Для таких СПАВ, как Гамма (культура Listeria sp 7) и De-sol-A (культуры типа 7 и I') после 72 ч культивирования наблюдается незначительное понижение рН с 5 до 4,95, с 4,5 до 4,4 и с 4,45 до 4,4 соответственно. Это, вероятно, связано с тем, что протекала деструкция жировых веществ до глицерина и жирных кислот, которые и способствовали созданию кислой среды. Химизм этого процесса можно представить следующим образом:

О

 //

СН2-С

\\

R

О СН2-ОН

 // 3 ОН – ½

CН-С –® СН-ОН + RCOO-

\\ ½

R СН2-ОН

O

 //

CH2-C

\\

R

Источником углерода в синтетических средах для культур рода Listeria sp являлись СПАВ различной химической природы. Использование данных ингредиентов в качестве питательного субстрата подтверждалось уменьшением концентрации СПАВ в процессе культивирования.

На основании данных, представленных в табл. 6–8 можно сделать вывод о том, что концентрация исследуемых СПАВ уменьшается. Максимальная степень деструкции была характерна для сред, содержащих Превоцелл W-OF-7. Концентрация за 96 ч уменьшилась с 0,47 до 0,09 г./дм3 – для культуры Listeria sp 3, то есть на 81%, с 0,48 до 0,06 г./дм3 (культура типа 7) – на 88%, с 0,46 до 0,06 г./дм3 (культура типа I') – на 87%. Минимальная степень деструкции наблюдалась для составов, содержащих Гамма и De-sol-A и составила 31,3 и 65,3% соответственно. Вероятно, такое небольшое уменьшение концентрации СПАВ связано не только с вовлечением их в клеточных метаболизм, но и с частичной их адсорбцией на поверхности стенок сосудов и клеток микроорганизмов.

Интенсивное вовлечение неионогенного СПАВ Превоцелл W-OF-7 в метаболические процессы, возможно, связано с тем, что он имеет как гидрофобную, так и гидрофильную группу из органических веществ, что определяет принципиальную возможность окисления с обоих концов молекулы. Биохимический распад НПАВ происходит путем карбоксилирования конечной метильной группы алкильной цепи с последующим ее окислением и гидролизом полиэтиленгликолевой цепи.

Для подтверждения полученных данных был проведен качественный анализ деструкции СПАВ с использованием спектрофотометра ИКС-29 производственного объединения ЛОМО. Для этого из приготовленной пробы готовили суспензию в виде пасты с несколькими каплями вазелинового масла, количественно переносили в нижнюю крышку кюветы и устанавливали в канале спектрофотометра.

На спектрограммах, представленных на рис. для Превоцелл W-OF-7, Wetter HAC, Гамма, De-sol-A в области валентных высоких колебаний средней интенсивности появлялись полосы поглощения в диапазоне 2940–2910 см-1, 3000–2850 см-1, которые можно отнести к валентным колебаниям алкильной части молекулы, что по литературным данным составляет 3350–3200 см-1. Полосы поглощения 1650–1300 см-1 можно охарактеризовать наличием оксиэтильной части молекул, что по литературным данным соответствует 1460–1000 см-1.

Как видно из рис. и рис. (приложение 2) для всех СПАВ, за исключением Превоцелла W-OF-7 (культура рода Listeria sp I' и 7) и Гаммы (Listeria sp I') через 48 ч культивирования наблюдается увеличение пиков, а затем к 96 ч – сглаживание пиков. Это объясняется, вероятно, тем, что на начальном этапе в результате деструкции образуются какие-либо вещества, затем СПАВ начинают вовлекаться в конструктивно-энергетический обмен. Наиболее полно утилизировался СПАВ De-sol-A культурой рода Listeria sp 7, его молекула подвергалась деградации сразу с 2-х сторон – с оксиэтильной цепи и углеводородного радикала. Для СПАВ, которые являлись исключением наблюдается увеличение пиков на протяжении 96 ч.

Как видно из данных табл. 6–8, на протяжении всего периода культивирования наблюдается увеличение протеолитической активности, которая указывает на разрушение белка. Так, минимальная величина протеолитической активности после 96 ч культивирования была характерна для составов с Wetter HAC (культура типа 7) и Гамма (культура типа I') и составила по 12,88 ед/г каждая. Постепенно микроорганизмы начинали вовлекать в конструктивно-энергетический обмен и шерстный жир, который входил в состав жидких синтетических сред, поэтому ферментный препарат обладал и липолитической активностью. Так, максимальное значение данной величины наблюдалось для сред, содержащих в своем составе Wetter HAC (культура рода Listeria sp 7) – 85,71 ед/г, Гамма (культура типа 3) – 76,0 ед/г и 57,14 ед/г – для Превоцелл W-OF-7 (культура типа I'). Повышение липолитической активности наблюдалось на конечной стадии развития прокариотических организмов, так как в это время жировые вещества наиболее полно вовлекаются в метаболические процессы. Преобладание липолитической активности над протеолитической составило 3–4 раза.

Таким образом, можно сделать вывод о том, что максимальная степень деструкции характерна для СПАВ типа Превоцелл W-OF-7 (85,3%), Wetter HAC (79,3%). Максимальная липолитическая и минимальная протеолитическая активности наблюдались у экзофермента, продуцированного на среде, содержащей СПАВ Гамма (культура типа 3) – 76,0 ед/г и 13,72 ед/г соответственно, у белка, продуцированного Wetter HAC (культура типа 7) – 85,71 и 12,88 ед/г, а также у белка, продуцированного Превоцелл W-OF-7 (культура типа I') – 57,14 и 13,16 ед/г. У выше перечисленных СПАВ наблюдается и максимальная концентрация белка. Следовательно, у ферментных препаратов, продуцируемых на синтетических средах культурами рода Listeria sp 3,7, I', содержащих такие СПАВ, как Гамма, Wetter HAC и Превоцелл W-OF-7. Данные СПАВы наиболее полно вовлекались в конструктивно-энергетический обмен и были использованы для дальнейших исследований при разных значених активной реакции среды.

Для дальнейшего эксперимента готовили среды, содержащие в качестве источника углерода Превоцелл W-OF-7, Wetter HAC, Гамма и создавали различные рН (кислая, нейтральная и щелочная). В среду с Превоцелл W-OF-7 вводили со скошенного агара культуру рода Listeria sp I', c Wetter HAC – культуру типа 7 и с Гамма – культуру типа 3. Культивирование проводили при температуре (38±0,5)0С при переменном механическом воздействии на «Shaker Type» с частотой колебания 250 об/мин и амплитудой 6 в течении 72 ч. Через каждые 24 ч снимали следующие показатели: КОЕ, рН, кислотность, мутность, концентрацию белка (г/дм3), а также липолитическую и протеолитическую активности. Данные определений представлены в табл. 9.

Как видно из табл. 9, величина КОЕ во всех случаях увеличивается. На это указывает увеличение мутности в кислой и нейтральной средах. В щелочной среде роста для всех СПАВ и культур не налюдается, но о развитии микроорганизмов говорит резкое повышение мутности после 48 ч культивирования в 2–3 раза и увеличение концентрации белка с 0,36 до 1,57 г./дм3 – для Превоцелл W-OF-7, с 0,18 до 0,55 г./дм3 – для Wetter HAC и с 0,22 до 0,53 г./дм3 – для Гамма. Максимальная концентрация белка наблюдается при рН=7,35 у cреды, содержащей в качестве источника углерода Превоцелл W-OF-7 (2,85 г./дм3) и при рН=4,85 у cреды с Wetter HAC (2,69 г./дм3).

В кислой и щелочной средах, частично в кислой, средах наблюдается уменьшение величины активной реакции среды, что связано с деструкцией жировых веществ с образованием жирных кислот.

Минимальное значение протеолитической активности характерно для среды, содержащей в своем составе Wetter HAC при рН=4,85 (7,96 ед/г) и Превоцелл W-OF-7 при рН=7,35 (7,13 ед/г) после 72 ч культивирования. В щелочной среде данный показатель во всех случаях был практически одинаковый. Максимальной липолитической активностью (деструкцией жировых веществ) обладали те же СПАВ: Wetter HAC (рН=4,85), Превоцелл W-OF-7 (рН=7,35 и рН=8,55) и ее значение составило 85,50; 89,47; 72,55 ед/г соответственно.

Таким образом, синтетическую среду, содержащую ферментный препарат, продуцируемый культурой рода Listeria sp I', и Превоцелл W-OF-7 при всех значениях активной реакции среды (рН<7, рН~7, рН>7), а также Wetter HAC и ферментный препарат, продуцируемый культурой рода Listeria sp 7 при рН<7, могут быть использованы для дальнейшего проведения процесса обезжиривания.

3.3 Изучение возможности проведения процесса обезжиривания I с применением ферментного препарата

Целью данного этапа эксперимента было получение ферментных препаратов на средах, содержащих в качестве источника углерода СПАВ (Превоцелл W-OF-7 с рН<7, рН~7, рН>7 и Wetter HAC с рН<7) и шерстный жир, с последующим их применением для проведения процесса обезжиривания I меховой овчины.

В результате выполненных ранее экспериментов были разработаны оптимальные условия культивирования культур рода Listeria sp I' и 7 c целью получения комплексного ферментного препарата с заданными свойствами. Состав синтетических сред представлен в табл. 10.

Таблица 10. Состав синтетических сред

Среды культивировали в течение 72 ч при температуре (38±0,5)0С при переменном механическом воздействии на «Shaker Type» с частотой колебаний 250 об/мин и амплитуде 6.

В начале культивирования (0 ч) и через 72 часа (перед обезжириванием) снимали следующие показатели: рН, кислотность, мутность, концентрацию белка, КОЕ, липолитическую и протеолитическую активности, которые представлены в табл. 11.

Как видно из данных табл. 11, величина КОЕ во всех случаях возрастает, что подтверждается увеличением мутности (для Превоцелл W-OF-7 c рН=4,82 показатель мутности изменяется с 0,12 до 0,30). Увеличение КОЕ объясняется ростом числа микробных продуцентов за счет достаточного количества субстрата. Наблюдаемое уменьшение активной реакции среды и увеличением кислотности, вероятно, происходит за счет деструкции жировых веществ с образованием жирных кислот.

Таблица 11. Влияние вида СПАВ и активной реакции среды на свойства ферментного препарата, продуцированного культурами рода Listeria

Страницы: 1, 2, 3, 4