Репликация ДНК

Репликация ДНК

БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Биологический факультет

РЕПЛИКАЦИЯ ДНК.

                                                                      Реферат

студента 3 курса 6 группы

                                                       Ковальчука К.В.

Минск 2003г.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение  ……………………………………………………………………………….3                                                                                                                           

Общий механизм репликации …………………………………………………………4                                                                                         

Основные ферменты репликации ……………………………………………………..5

Репликация у прокариот ……………………………………………………………….7                                                                                                  

Репликация у эукариот …………………………………………………………………9                                                                                                     

Заключение …………………………………………………………………………….. 11                                                                                                                       

Литература ………………………………………………………………………………11                                                                                                                         

Введение.

Вся информация о строении и функционировании любого организма содержится в закодированном виде в его ге­нетическом материале, основу которого у подавляющего числа организмов составляет ДНК.  Роль ДНК заключа­ется в хранении и пере­даче генети­ческой (наследственной) информации в живых организмах. Чтобы эта инфор­мация могла переда­ваться от одного поколения клеток (и организмов) к другому, необходимо её точное копиро­вание и после­дующее распределение её копий между потомками. Процесс, с помощью которого создаются копии молекулы ДНК, называется реплика­цией. Перед тем как раз­делится, клетки с помощью реп­ликации создают копию своего генома, и в результате клеточного деления  в каждую дочер­нюю клетку переходит одна копия. Бла­годаря этому, генетическая информация, содержащаяся в роди­тельской клетке, не исчезает, а сохраняется и пере­даётся потомкам. В случае многоклеточных организмов пе­редача этой информации осуществляется с помощью половых клеток, образующихся в результате мейотического деления и также несущих копию генома (гаплоидного). Их слияние приводит к объеди­нению двух родительских геномов в одной клетке (зиготе). Из неё развивается организм, клетки которого не­сут ге­нетическую информацию обоих родительских организмов. Таким образом, основное значение репликации за­ключается в снабжении потомства генетической информацией. Для обеспечения стабильности организма и вида ДНК должна реплицироваться полностью и с очень высокой точностью, что обеспечивается функционированием определённого набора белков. Замечательной особенностью ДНК является то, что она несёт гены кодирующие эти белки, и, таким образом, информация о механизме её собственного удвоения за­кодирована в ней самой.

Общий механизм репликации.

Точное самовоспроизведение ДНА  возможно благодаря её особой структуре. Модель структуры ДНК была об­народована Ф.Криком и Д.Уотсоном в 1953 году. Согласно ей  ДНК представляет собой длинную двухцепочечную полимерную молекулу. Мономерами  являются нуклеотиды, соединённые в каждой цепи фос­фодиэфирными связями. Сахарофосфатный остов молекулы, который состоит из фосфатных групп и дезоксири­бозных остатков соединён­ных 5'-3'-фосфодиэфирными связями , образует как бы боковины винтовой лестницы, а пары оснований -её ступеньки.  Две полинуклеотидные цепи навиты одна на одну, образуя двой­ную спираль. Вместе они удерживаются водородными связями , образующимися между комплиментарными основаниями про­тивоположных цепей (между А и Т; G и C). Цепи молекул ДНК антипараллельны: одна из них имеет направление 5¢®3¢, другая 3¢®5¢. Последовательность мономер­ных единиц (дезоксирибонуклеоти­дов) в одной её цепи соответствует (ком­пли­ментарна) последовательности дезоксирибонуклеотидов в другой. Уот­сон и Крик предположили, что для удвое­ния ДНК должны произойти раз­рыв водородных связей и расхожде­ние це­пей(рис.1) и что удвоение ДНК происходит путём последовательного соедине­ния нуклеотидов на мат­рице материнской цепи в соответствии с правилом комплиментарности. В даль­нейшем эта матричная природа механизма репликации была подтверждена многочисленными опытами. Подтверждение также получил пред­ложенный полуконсервативный способ репликации двухцепочечной ДНК {Мезельсон, Сталь, 1958 (объект-E.coli); Тэйлор,1958( объект-Vicia faba)}.Согласно ему, в результате дупликации образуются две пары цепей, в каждой из которых только одна является родительской (консервативной), а вто­рая- заново син­тезированной.  Другие механизмы (консервативный, дисперс­ный) не под­твердились.

Ауторадиографический анализ, проведённый в начале 60-х гг. (Керренс,1963) на реплицирующихся хро­мосомах меченых 3Н-тимидином, показал наличие опре­делённой   зоны, где происходила репликация. Эта зона двига­лась вдоль роди­тельской двойной спирали. Из-за Y-образной структуры её назвали реплика­тивной вилкой. Именно в ней и происходят основные процессы, обеспечивающие синтез ДНК. Вилки образуются в структуре, называемой репликативный пузырёк. Это области хромосомы, где две нити родительской спи­рали ДНК разъединяются и служат как матрицы для синтеза ДНК. Это место, где происходит инициация реп­ликации, называется точкой начала реп­ликации (точкой ori). Образование репликативных вилок происходит в двух направлениях (двунаправленная репликация) и их они затем движутся до встречи с другой вилкой или с кон­цом матрицы. В некоторых слу­чаях наблюдается движение только одной вилки, тогда как вторая является ста­ционарной (однонаправленная репликация). У прокариот на нуклеоиде находится обычно только одна точка ori, тогда как у эукариот их много (например, у дрожжей порядка 500), рас­положенных на хромосоме на расстоянии 20-35 т.п.н. Участок между двумя точками ori получил название репли­кон. Скорость репликации у прокариот со­ставляет порядка 1000-2000 нуклеотидов в секунду, у эука­риот ниже из-за нуклеосомной органи­зации хроматина (10-200 нук­леотидов в секунду). Скорость репликации всей молекулы ДНК (или хромо­сомы) зависит от числа и распо­ложения точек ori.

Синтез ДНК в репликативной вилке проходит следующим образом. Цепи синтезируются в результате присоеди­нения 5¢-дезоксинуклеотидильных единиц дезоксирибонуклеотидтрифосфатов к 3¢-гидроксильному концу уже имеющейся цепи (праймер, затравка). За один акт репликации праймерная цепь удлиняется на один нуклеотид, при этом одновременно удаляется один остаток пирофосфата. Цепи синтезируются в направ­лении 5¢®3¢ вдоль мат­ричной цепи, ориентированной в противоположном, 3¢®5¢, направлении. Синтез Цепей в обратном направлении не происходит никогда, поэтому синтезируемые цепи в каждой репликативной вилке должны расти в противоположных направлениях. Синтез одной цепи(ведущей, лидирующей) происходит непрерывно, а другой (отстающей) импульсами. Такой механизм репликации называется полунепрерывным. Ведущая цепь растёт от 5¢- к 3¢-концу в направлении движения репликативной вилки и нуждается только в одном акте ини­циации. Рост от­стающей цепи также идёт от 5¢- к 3¢-концу, но в направлении противоположном движению реп­ликативной вилки. Для синтеза отстающей цепи должно произойти несколько актов ини­циации, в результате чего образуется множе­ство коротких цепей, называемых фрагменты Оказаки в честь от­крывшего их учёного - Р.Оказаки. Размеры их: 1000-2000 нуклеотидов у прокариот, 100-200 нуклеотидов у эукариот. По мере дви­жения репликативной вилки концы соседних фрагментов Оказаки соединяются с обра­зованием непрерывной отстающей цепи. Механизмы инициации репликации в точке ori и при образовании фрагментов Оказаки в принципе аналогичны. В обоих слу­чаях происходит образование РНК- затравок (дли­ной 10-12 нуклеотидов), комплиментарных матричной ДНК, в виде продолжения которых синтезируется но­вая цепь ДНК. В дальней­шем короткие вставки РНК  замещаются сегментами ДНК, которые затем объединя­ются с образованием не­прерывных цепей.

Основные ферменты репликации.

Репликация является ферментативным процессом, а не спонтанным как сначала предполагали Уотсон и Крик. В ре­пликации участвуют следующие основные группы ферментов.

ДНК-полимеразы. Ферменты, которые узнают нуклеотид материнской цепи, связывают комплиментарный нук­леозидтрифосфат и присоединяют его к 3¢-концу растущей цепи 5¢-концом. В результате образу­ется 5¢-3¢-диэфирная связь, высвобождается пирофосфат и растущая цепь удлиняется на один нуклеотид. Та­ким об­разом, ДНК-поли­мераза движется от 3¢- к 5¢-концу молекулы материнской ДНК, синтезируя новую цепь. ДНК-полимеразе для ра­боты нужен праймер (т.е. 3¢-ОН группа для присоединения нового нуклеотида) и матрица, детерминирующая при­соединение нужного нуклеотида. ДНК-полимеразы помимо полимеразной активности, имеют экзонуклеазную активность, они способны к гидролизу фосфодиэфирных связей в одной цепи ДНК или на не спаренном конце ду­плексной ДНК. За  один акт удаляется один нуклеотид, начиная с 3¢-конца цепи (3¢-5¢-экзонуклеаза) или с 5¢-конца цепи дуплексной ДНК (5¢-3¢-экзонуклеаза). Эти различные ак­тивности присущи разным сайтам полипептидной цепи ДНК-полимераз. 3¢-5¢-экзонуклеазная активность обеспечивает контроль за присоединением каждого нуклео­тида и удаление ошибочных нуклеотидов с расту­щего конца цепи. Все ДНК-полимеразы способы осуществлять данный тип реакции. Многие(но не все) ДНК-полимеразы обладают также 5¢-3¢-экзонуклеазной активностью. При сочетании 5¢-3¢-экзонуклеазной и поли­меразной актив­ностей происходит последовательное отщепление нуклеоти­дов с 5¢-конца одноцепочечного разрыва в дуп­лексе и удлинение цепи с 3¢-конца. В результате место разрыва пе­ремещается по цепи в направ­лении от 5¢- к 3¢- концу(так называемая ник-трансляция).

ДНК-лигазы --ферменты, осуществляющие соединение цепей ДНК, т.е. катализирующие образование фосфоди­эфирных связей между 5¢-фосфорильной и 3¢-гидроксильной группами соседних нуклеотидов в местах разрывов ДНК.  Для образования новых фосфодиэфирных связей требуется энергия в форме АТФ либо НАД.

ДНК-геликазы (ДНК-хеликазы)—ферменты, осуществляющие расплетание двойной спирали ДНК. Для разделения цепей ис­пользуется энергия АТФ. Геликазы часто функционируют в со­ставе комплекса, осуществляющего перемещение репликативной вилки и репликацию расплетённых цепей. Для расплетания дос­та­точно одного геликазного белка, но для  того. Чтобы максимизи­ровать скорость раскручивания. Несколько геликаз могут дейст­вовать совместно.

ДНК-топоизомеразы—ферменты, изменяющие степень сверхспиральности и тип сверхспирали. Путём одноцепочечного разрыва они создают шарнир, вокруг которого нереплецированный дуплекс ДНК, находящейся перед вилкой, может свободно вращаться. Это снимает механическое напряжение, возникающее при раскручивании двух цепей в репликативной вилке, что явля­ется необходимым условием для её непре­рыв­ного движения. Кроме того, топоизомеразы (типа II) обеспечивают разделение или образование катена­нов - сцеплен­ных кольцевых ДНК (образу­ются в результате репликации кольцевой ДНК), а также устране­ние узлов и спутанных клубков из длинной линейной ДНК. Су­ществует два типа топоизомераз. Топоизомеразы типа I уменьшают число сверхвитков в ДНК на единицу за один акт. Эти топоизомеразы надрезают одну из двух цепей, в результате чего фланкирующие дуплексные области могут повернутся вокруг интактной цепи, и затем воссоединяют концы разрезанной цепи. Эта реакция не      требует энергии АТФ, т.к. энергия фосфодиэфирной связи сохраняется благодаря тому, что тирозиновый остаток в моле­куле фер­мента выступает то в роли акцеп­тора, то в роли до­нора фосфорильного конца разрезанной цепи.

       Топоизомеразы типа II вносят временные разрывы в обе комплиментарные цепи, пропускают двухцепо­чечный сегмент той же самой или другой молекулы ДНК через разрыв, а затем соединяют разорванные концы. В резуль­тате за один акт снимаются два по­ложительных или от­рицательных сверхвитка. Топои­зомеразы типа II тоже ис­пользуют тирозиновые ос­татки для связывания 5¢-конца каждой разорванной цепи в то время . когда другой дуп­лекс проходит че­рез место разрыва.

              Праймаза—фермент, обладающий РНК-полимеразной активностью; служит для образования РНК-праймеров, необходимых для инициации синтеза ДНК в точке ori и дальнейшем для синтеза отстающей цепи.

Репликация у прокариот.

Наиболее изучен процесс репликации у Escherichia coli. У этой бактерии (как и ещё некоторых исследованных видов) в области точки инициации репликации (ori C, длиной примерно 245 п.н.) находятся повторы размером в 13 и 9 пар оснований (Рис.5). При инициации 10-20 молекул белка инициации реплика­ции Dna A связывается с четырьмя девятимерными  повторами (9-mers) и расплетает ДНК в районе тандем­ного набора тринадцатимеров, богатых АТ парами (что облегчает их расплетание, т.к. между А и Т только две водородные связи). Белок Dna C доставляет шестисубъединичный белок Dna B (геликаза) к матрице. На каж­дую из одиночных цепей садится по одному Dna B  и они затем двигаются в разных направлениях расплетая ДНК.

Рис.5 Модель инициации репликации в ori C E.coli.[3].

К геликазе присоединяется праймаза и синтезирует РНК-затравку.  Две ДНК-полимеразы  с помощью своих двух b-субъединиц прикрепляются к нити ДНК и начинают синтез ДНК. Расплетанию спирали способст­вует  SSB-белки, которые связываются с одноцепочечными участками ДНК, предотвращают образование шпи­лек и тем са­мым стабилизируют расплетённый дуплекс. Сбалансированное действие топоизомеразы II (гираза), способной индуцировать отрицательные сверхвитки(см.рис.4), и топоизомеразы I, снимающей отрицательные сверх­витки(см.рис.3) регулирует степень сверхспиральности ДНК и таким образом влияет на скорость движе­ния реп­ликативной вилки. 

У прокариот обнаружено три типа ДНК-полимераз. Их свойства приведены ниже.