Получение ферментных препаратов выращенных глубинным способом

Получение ферментных препаратов выращенных глубинным способом

Большинство ферментов очень чувствительно к термической обработке и нуждается в мягких режимах концентрирования. На рисунке были приведены данные по инактивации нейтральной протеиназы В. subtilis 103 в зависимости от температуры кипения раствора от 20 до 50 °С и температуры греющего пара от 90 до 120 °С. Из рисунка видно, что очень большое влияние оказывает температура теплоносителя. При низких температурах кипения (25 – 30 °С) происходит заметная инактивация ферментов (до 12 %), если температура греющего пара равна 120 °С. При температуре теплоносителя 90 – 100 °С и температуре кипения 35 – 40 °С потери активности не превышают 10 %. В зависимости от вида продуцента культуральная жидкость имеет различный химический состав и содержит различный комплекс ферментов, поэтому тепловые режимы вакуум-выпаривания уточняются экспериментальным путем.

Суммарные потери активности при вакуум-выпаривании в значительной степени зависят не только от режима концентрирования, но и от конструкции аппарата. Аппараты для стадии вакуум-выпаривания в последние годы значительно усовершенствованы, в десятки раз сокращена длительность процесса, что привело к значительному уменьшению потерь активности ферментов, а также позволило несколько ужесточить температурные режимы концентрирования ферментных растворов. Помимо трубчатых вакуум-выпарных установок с различным расположением трубой (горизонтальным, вертикальным и наклонным), со встроенной и выносной поверхностью нагрева, с использованием принудительной циркуляции созданы новые конструкции пленочных выпарных аппаратов, ультрацентробежных вакуум-выпарных установок и пластинчатых испарителей. Особый интерес представляют ротационные пленочные выпарные аппараты, где упариваемая жидкость в виде пленки движется по внутренней стенке аппарата. Лопатки, смонтированные на вращающемся роторе, непрерывно направляют движение ее сверху вниз. Время прохождения жидкости через аппарат составляет несколько секунд. В настоящее время фирма «Альфа-Лаваль» изготовляет вакуум-выпарные центробежные аппараты типа «Центритерм». Они очень компактны, время контакта ферментного раствора с обогревающей поверхностью предельно сокращено (не более 1 с), потери не превышают 10 %, производительность этих установок от 800 до 4800 л/ч.

Создана центробежная вакуум-выпарная установка пленочного типа производительностью 800 л/ч по испаренной влаге. Время контакта культуральной жидкости с теплоносителем не более 1 с, температура греющего пара 60 – 80 °С. Для увеличения производительности можно монтировать установку из трех модулей, каждый из которых работает либо автономно, либо последовательно, либо первые два модуля работают параллельно и соединены с третьим модулем последовательно. Представляет интерес для ферментной промышленности центробежная пленочного типа вакуум-выпарная установка «Единство» (Югославия) производительностью до 200 л/ч и с температурой упаривания 30 – 40 °С. Хорошие технологические показатели имеют роторные выпарные аппараты фирмы «Люва» (Швейцария), имеющие производительность по испаренной влаге от 50 до 200 л/(м2·ч). Французская фирма APV изготовляет пластинчатые вакуум-выпарные установки производительностью до 20 000 л/ч.

Несмотря на наличие высокопроизводительных вакуум-выпарных аппаратов полностью устранить недостатки метода вакуум-выпаривания не удается (потери активности, выпадение осадков и т. д.), и этот метод все больше заменяется методом ультрафильтрации.

1.3.6 Другие промышленные методы очистки, концентрирования и стабилизации ферментных препаратов

В ферментной промышленности для очистки белков от различных низкомолекулярных примесей (ионов солей, сахаров и т.д.) применяют мембранные методы очистки: диализ и электродиализ и баромембранные методы: обратный осмос, ультрафильтрацию, микрофильтрацию и тонкую фильтрацию.

Также используют осаждение белков органическими растворителями, высаливанием, органическими полимерами и путём избирательной денатурации; разделение белов хроматографическими методами.

Сушка ферментных препаратов имеет целью получить стабильный при хранении ферментный препарат из культуральной жидкости, её концентратов, из пастообразной массы, образующейся при высаливании, осаждении фермента спиртом или другими осадителями и т. д. Для обезвоживания ферментных растворов и осадков применяют сушку в вакуум-сушильных шкафах, распылительных и сублимационных установках. При этом возникает ряд проблем, связанных с большой термолабильностью ферментов.

Получаемые ферменты порой с целью стабилизации иммобилизуют, микрокапсулируют, гранулируют.

1.4 Микробиологический и биохимический контроль производства

Независимо от способа культивирования с момента засева продуцентом стерильной питательной среды ведется контроль за ростом культуры и образованием ферментов. Для каждого вида продуцента и способа культивироваиня устанавливается своя периодичность отбора средних проб растущей культуры. Отобранные пробы подвергаются микроскопированию и визуальному просмотру. С целью выявления возможных заражений производится периодический высев проб на агаризорованные среды с введением факторов, подавляющих рост продуцента. Постоянно ведется определение накопления в культуре ферментативной активности. При глубинном культивировании ведут контроль за потреблением основных лимитирующих компонентов среды (углеводы, N, Р), измеряют рН культуры.

Все показатели роста культуры, изменения состава среды и накопления ферментов и т. д. заносятся в лабораторный журнал.

На всех стадиях выделения ферментов проводят анализы активности, определяют величины потерь и выход товарного продукта. Готовые препараты ферментов подвергают особенно тщательному исследованию, особенно те, которые применяются в медицине и в пищевых продуктах. Препараты медицинского назначения не должны содержать микроорганизмов. Препараты для хлебопекарной, мясной и рыбной промышленности контролируют на содержание спор грибов-продуцентов и на присутствие спороносных бактерий. Споры или клетки продуцента в готовом продукте должны отсутствовать, а предельная норма обсеменённости микрофлорой определяется в каждом конкретном случае. Например, в грибных препаратах из поверхностных культур она не должна превышать 1·105 клеток на 1 г препарата. При контроле готовых препаратов на обсеменённость микроорганизмами делают высевы проб от каждой партии на твердые среды (МПА и сусло-агар) в чашки Петри. Заражение выражается количеством микроорганизмов на 1 г препарата. Контроль на зараженность спороносными бактериями проводится путем высева нагретых до 80 °С проб на чашах Петри с агаризорованной средой. Культивирование для выявления бактериального заражения ведут при 37 °С в течение 24 ч, а для грибного – при 30 °С в течение 48 – 72 ч.

В готовых препаратах определяют влажность и активность в стандартных единицах на 1 г препарата.

Технические жидкие и сухие ферментные препараты анализируют на активность ферментов, содержание сухого вещества и в зависимости от назначения на наличие микробного загрязнения. При контроле высокоочищенных препаратов помимо определения загрязненности микробами и активности ферментов проводятся анализы на содержание белка, зольных элементов, углеводов и других специфических свойств ферментов.

Кроме того, любой ферментный препарат перед промышленным производством подвергают длительной проверке в специальных медицинских учреждениях на токсичность, особенно если препарат предназначен для пищевой и медицинской промышленности. Токсичность препарата зависит от способности микроорганизма синтезировать в процессе жизнедеятельности токсины или канцерогенные вещества, а также от состава используемой для культивирования среды и способов выделения фермента. Исследования на токсичность проводят на лабораторных животных, которым вводят внутримышечно и перорально ферментные препараты в различном виде и дозировке и наблюдают реакцию организма.

Только после тщательного биологического исследования при положительных результатах дается разрешение на промышленное производство препарата и на его применение в пищевой промышленности, медицине, сельском хозяйстве и других областях.

1.5 Охрана труда и техника безопасности на предприятиях, выпускающих ферментные препараты

Инженерные мероприятия являются наиболее важными. Они призваны максимально предотвратить выход и вынос ферментных препаратов в помещения и за пределы предприятия, т. е. исключить контакт с ними человека. Известно также, что в производстве помимо самих ферментных препаратов используется ряд веществ, обладающих токсическими свойствами. Попадая в организм человека, такие вещества могут вызвать отравления и даже профессиональные заболевания.

Степень воздействия различных веществ на организм зависит от дисперсности раздражителя, его концентрации, продолжительности воздействия и путей проникновения в организм. Основными путями проникновения токсических веществ в организм являются органы дыхания (при загрязнении воздуха производственных помещений микроорганизмами – продуцентами, парами, пылью ядовитых веществ и аллергентов), пищеварительный тракт (при приеме пищи в цехе, недостаточно тщательном мытье рук перед едой), а также кожа (при загрязнении ее токсическими веществами и спорами продуцента). На предприятиях, выпускающих ферментные препараты, при использовании поверхностного способа культивирования продуцентов определенную опасность для окружающих представляет воздух заводских помещений, если он загрязнен органической пылью, содержащей отдельные компоненты питательных сред (мелкие частицы отрубей, ростков, опилок и др.), полупродукты производства (культура продуцента), готовую продукцию (мельчайшие частицы порошкообразных препаратов) и, главное, споры и конидии микроорганизмов – продуцентов ферментов. Наиболее тяжелые условия для работающих в цехе хранения и транспортирования сыпучих компонентов сред, приготовления питательных смесей и в цехах, связанных с приготовлением спорового посевного материала, транспортированием и дроблением готовой культуры, а также в производственных помещениях, где проводятся измельчение высушенных осадков ферментов и наполнителей, их смешивание и фасование готовых препаратов. При отсутствии на предприятии специальных герметизирующих устройств в местах пыления и при нарушении нормальной работы приточно-вытяжной вентиляции во всех помещениях содержание органической пыли повышается до 80 – 125 мг/м3, что отрицательно действует на здоровье работающих и может привести даже при более низких концентрациях органической пыли в воздухе к воспламенению и взрыву.

Наибольшая опасность для персонала при поверхностном способе культивирования микроорганизмов – это непосредственный контакт с культурой продуцента. Должна быть точная гарантия в том, что данный микроорганизм не патогенен и что он тщательно обследован перед передачей на производство. При работе с микроорганизмами используются индивидуальные средства защиты, не допускается вход в растильную камеру во время роста культуры, особенно на стадии спорообразования и подсушивания культуры. Отбор проб культуры должен проводиться пробоотборниками, исключающими возможность попадания культуры на кожу работающего. Нарушение правил работы, отсутствие аспирационных и герметизирующих устройств могут способствовать увеличению запыленности воздуха, а при работе с готовой культурой – повышению концентрации спор микроскопических грибов в воздухе до 104 – 105 на 1 м3, что может повлечь за собой заболевание работающих. Наиболее часто отмечаются поражения кожи и слизистых – контактный аллергический дерматит. Часто при прекращении контакта с аллергентом явления дерматита исчезают, но у некоторых лиц наблюдается явление сенсибилизации и при возобновлении работы вновь появляются признаки дерматита.

Основными мерами профилактики в производстве ферментных препаратов являются: максимальная герметизация оборудования и механизация процессов; применение индивидуальных средств защиты (комбинезоны, шлемы-капюшоны, халаты, перчатки, косынки, респираторы); ежедневный теплый душ после работы, обеспыливание, стерилизация рабочей одежды; мытье рук и полоскание рта перед приемом пищи; ежегодные медицинские осмотры; прием во время работы молочного колибактерина или молока. К работе на предприятиях ферментной промышленности нельзя допускать лиц с заболеваниями почек, печени, желудочно-кишечного тракта, легких, а также склонных к кожным болезням.

Уменьшение запыленности заводских помещений достигается путем герметизации оборудования. Если это невозможно по местным условиям, то устанавливают устройства с индивидуальной аспирацией данного узла. Операции, связанные с пылевыделением, необходимо изолировать от других помещений, по возможности механизировать и автоматизировать.

При глубинном культивировании продуцентов ферментов опасность поражения работающих спорами продуцента уменьшается, сокращается число технологических участков, являющихся источником пыли. Тщательного контроля в производствах с этим видом культивирования требуют цех приготовления питательных сред, операции по транспортированию и хранению сыпучих компонентов среды, а также цех получения и измельчения ферментных препаратов.

Особенно большое внимание уделяется на предприятиях, выпускающих ферментные препараты и другие продукты микробного синтеза, вопросам очистки воздуха, используемого для аэрирования растущей культуры перед его выбросом в атмосферу. Повышенная обсеменённость отходящего воздуха может вызвать накопление в атмосфере, прилежащей к заводу, микроорганизмов-продуцентов, что недопустимо. Поэтому весь отходящий воздух должен тщательно очищаться и контролироваться на количество микроорганизмов и их видовой состав. Удаляемый из помещений воздух, загрязненный микроорганизмами, очищают на масляных и обеспложивающих фильтрах типа ФТО-1000 или ФТО-750. Если воздух просто запылен, его очищают на обычных масляных фильтрах, циклонах и рукавных фильтрах.

Нормальные условия для работающих на предприятиях ферментной промышленности поддерживаются с помощью приточно-вытяжной вентиляции, обеспечивающей 4 – 8-кратный воздухообмен в вентилируемом помещении. Воздух, подаваемый в рабочие помещения, за исключением специальных помещений (с растительными камерами для поверхностного культивирования), должен иметь относительную влажность около 60 – 65 % и температуру 18 – 20 °С. Он должен быть полностью очищен от пыли, а для некоторых цехов – и от микроорганизмов. При использовании мокрой уборки полов рекомендуется для обеспечения нормальных условий делать полы с небольшим уклоном и снабжать их трапами, позволяющими быстро удалять воду с поверхности пола. Стены и полы предприятий ферментной промышленности выполняются из керамической облицовочной плитки для улучшения санитарных условий. При размещении оборудования и коммуникаций учитывается необходимость удаления пыли с выступающих частей оборудования и особенно с вентиляционных коробов. Потолок, верхнюю часть стен и оборудование следует чаще красить для поддержания соответствующих гигиенических условий.

В случае работы с микроскопическими грибами и при повышенной влажности воздуха наблюдается рост микроорганизмов на стенах и в малодоступных запыленных местах, что создает антисанитарные условия труда. В таких случаях рекомендуется их красить фунгицидными красками. Фунгицидные краски могут быть пяти типов: 1) на основе хлорированного каучука. Они устойчивы к высокой относительной влажности воздуха, но очень трудно наносятся на поверхность; 2) с высоким содержанием галондозамещенного фенола (например, пентахлорфенола); 3) содержащие органические соединения меди (например, медь-8-хннолат или нафтенат меди); 4) содержащие ртуть или оловоорганические соединения (например, фенилмеркуриолеат, дифенилртуть и др.); 5) с высоким содержанием цинка.

На предприятии должен осуществляться строгий и постоянный контроль за наличием в воздухе токсических газов и паров. Некоторые вещества легко обнаруживаются по запаху даже в концентрациях, меньших установленных нормами (хлороформ, этиловый эфир, ацетальдегид, аммиак, бром, метанол) – от 0,3 до 600 мг в 1 м3 воздуха в зависимости от соединения. Другие вещества могут содержаться в воздухе в значительно больших количествах, чем допускается по нормам, но не будут замечены работающими. Это более опасно, так как может привести к отравлению.

Существуют специальные нормы предельно допустимых концентраций (ПДК) в воздухе помещений ряда химических веществ.

В ряде помещений предприятий ферментной промышленности могут создаваться неблагоприятные климатические условия в результате несоблюдения оптимальной температуры, влажности, скорости движения воздуха, повышенного излучения тепла оборудованием. Эти факторы ухудшают самочувствие и работоспособность персонала, повышаются утомляемость и потоотделение, которое может увеличиться по сравнению с нормой в 8 – 10 раз и достичь 350 – 400 г/ч теряется тканевая жидкость, и наступает состояние чрезмерной усталости и слабости. Нормальные климатические условия в помещениях должны устанавливаться с помощью приточно-вытяжной вентиляции, а также путем максимальной автоматизации и механизации процессов и управления ими из специальных помещений с кондиционированным режимом. Все аппараты, излучающие тепло или холод, должны покрываться надежным изоляционным покрытием. Если избежать неблагоприятных климатических условий невозможно, то для поддержания нормального водно-солевого баланса организма необходимо обеспечить работающих подсоленной газированной водой (3 – 5 г соли на 1 л).

Цехи, связанные с использованием растворителей и других химических веществ, должны тщательно вентилироваться, а воздух этих помещений – контролироваться на присутствие токсических газов и паров. Повышенное содержание химических веществ в воздухе производственных помещений часто связано с неисправностью трубопроводов, с неправильной установкой и эксплуатацией кранов и вентилей, а также с нарушениями герметизации фланцевых соединений разъемных аппаратов, например в результате разбухания и износа прокладочных материалов. Такие явления крайне опасны, так как они могут привести не только к ухудшению условий работы, но и к аварии, поэтому необходимо регулярно и тщательно проверять аппараты, вентили и соединения на герметичность.

Промышленное производство любых продуктов, в том числе ферментных препаратов, организуется на основании технологического регламента, где обязательной частью является раздел «Основные правила безопасности ведения процесса». На заводе для каждого аппарата узла технологической схемы разрабатываются инструкции по технике безопасности, которые вывешиваются на видном месте.

Безопасность условий труда во многом зависит от своевременного проведения планово-предупредительного ремонта (ППР), внутреннего наружного осмотра оборудования по определенному графику в период работы завода между капитальными ремонтами. Перенесение сроков текущего ремонта, установленных месячным графиком ППР, запрещено, изменение сроков более 2 дней допускается только с разрешения главного инженера и оформляется актом.

Взрыво- и пожаробезопасность. Производство ферментных препаратов часто связано с использованием легковоспламеняющихся веществ поэтому относится к категории взрыво- и пожароопасных производств. Источниками взрыва пожара на предприятиях ферментной промышленности могут быть различные органические растворители в цехах выделения ферментных препаратов на участке регенерации растворителей. Взрывоопасны также цехи с высокой запыленностью, особенно, где есть места скопления мельчайшей пыли ферментных препаратов, где используется пневмотранспорт, установлены распылительные сушилки, складские помещения и т. д. Степень пожарной опасности определяется свойствами жидкостей: пределом взрываемости (воспламенения) паров в воздухе; температурой самовоспламенения паров жидкости в воздухе; склонностью данной жидкости к самовозгоранию в определенных условиях и к электролизации. Категории пожароопасности помещений определяются в соответствии со строительными нормами правилами (СНиП).

Особую пожарную опасность представляют цех получения очищенных ферментных препаратов с помощью органических растворителей и цех по регенерации органических растворителей. Эти цехи должны быть изолированы от смежных невзрывоопасных помещений глухими (брандмауерными) стенами, сообщение между ними допускается только по специальным переходам. Они должны иметь специальный пожарный выход, а при высоте помещения больше 10 м – наружную металлическую пожарную лестницу с уклоном не более 45° и шириной не менее 0,7 м. Взрывоопасные помещения должны покрываться только легко сбрасываемыми при взрывной волне кровельными перекрытиями.

Все электродвигатели, пусковые устройства которых могут искрить, должны быть герметизированы и изготовлены во взрывобезопасном исполнении. Электрооборудование должно удовлетворять требованиям, изложенным в Правилах устройства электроустановок (ПУЭ).

Емкости для хранения растворителей устанавливают на значительном расстоянии от производственного здания по основному направлению ветра для данной местности. Безопасность хранения легковоспламеняющихся и горючих жидкостей обеспечивается путем установления в резервуарах и цистернах выхлопного клапана и огнепреградителя.

Трубопроводные линии для легколетучих и взрывоопасных жидкостей окрашивают в коричневый цвет и удаляют от других коммуникаций.

От прямых ударов молний предусматривается оборудование громозащиты. Для защиты от проявления статического электричества всю аппаратуру, металлоконструкции, трубопроводы и емкости с органическими растворителями, воздуховоды и резервуары заземляют.

Все оборудование, имеющее открытые вращающиеся или движущиеся элементы, закрывают защитными коробами или сетками.

Оборудование и установки, издающие шумы, должны по возможности герметизироваться и устанавливаться на амортизационных подушках или в специальных помещениях.

Оборудование и устройство бытовых помещений (кроме туалетных, курительных комнат и помещений для кормления грудных детей) осуществляются в зависимости от санитарной характеристики производственных процессов.

Повышенная взрыво- и пожароопасность ферментных предприятий, разнообразие используемых аппаратов и устройств, опасность, которую представляют продуценты ферментов, вызывают необходимость тщательного изучения и освоения правил техники безопасности и промышленной санитарии. Занятия, инструктаж и проверку полученных знаний и навыков следует проводить не реже 1 раза в квартал. Каждый вновь поступающий на работу проходит обязательный инструктаж. Изучение правил техники безопасности и правил промышленной санитарии обязательно для каждого студента.

Инструкции по технике безопасности и правила санитарии разрабатываются для каждого рабочего места, выдаются на руки исполнителям и вывешиваются на видных местах. Инженерный персонал завода должен внимательнейшим образом следить и неукоснительно исполнять сам все правила техники безопасности и промышленной санитарии. Ответственность за соблюдение правил охраны труда несут руководители подразделений, а в целом по предприятию – директор и главный инженер.

2. Производство протеолитических ферментных препаратов

Ферменты, обладающие способностью гидролизовать белки, широко используются в самых различных отраслях промышленности, сельском хозяйстве и медицине. Протеолитические ферменты выпускаются промышленностью в большом количестве, это крупнотоннажное производство. Протеиназы применяются в пищевой технологии, где идет процесс с использованием микроорганизмов (дрожжи, молочнокислые бактерии и др.). Введение в процесс протеиназ позволяет в результате гидролиза белков обрабатываемого сырья обеспечить дрожжам нормальные условия жизнедеятельности, что улучшает весь технологический процесс, особенно в пивоварении, спиртовой промышленности, виноделии. В ряде исследований показано, что протеолитические ферменты могут использоваться в хлебопечении для уменьшения длительности замесов при производстве заварных сортов хлеба и специальных изделий, изготавливаемых из муки с сильной клейковиной. Внесение в тесто небольших количеств амилаз и протеиназ увеличивает газообразование, улучшает аромат, цвет корочки и мякиша, позволяет сократить процесс тестоведения. Широко применяются протеиназы для снятия различного рода белковых помутнений в пивоварении и виноделии и для ускорения фильтрационных процессов. Протеолитические ферменты используются для мягчения (тендеризации) мяса, мясных изделий, рыбы, что облегчает и ускоряет обработку полупродуктов, повышает их качество. В мясной, рыбной промышленности и в кулинарии используются не только микробные протеиназы, но и протеиназы, получаемые из растительного и животного сырья. Высокоочищенные протеолитические ферменты могут с успехом использоваться в крахмало-паточной промышленности для выделения особенно чистого крахмала без сопутствующих белков.

Комплексные ферментные препараты, содержащие протеиназы, используются в пищеконцентратной и консервной промышленности при приготовлении концентратов из трудно развариваемых круп, гороха, фасоли и др.

Протеииазы могут использоваться в кожевенной промышленности для обработки кож в процессе их обезволашивания и мягчеиия с большим эффектом: улучшается качество шкуры, сохраняется толщина готовой кожи, отделенная щетина может использоваться как вторичное сырье, а главное – резко улучшаются условия труда работающих. Используются протеиназы при обработке натурального шелка для процесса снятия белка с поверхности шелковой нити.

Самая большая потребность в протеолитических ферментах связана с их использованием в составе синтетических моющих средств (CMC). Особенно эффективна обработка протеиназосодержащими CMC больничного белья, загрязненного кровью и другими выделениями белковой природы.

Протеолитические препараты, особенно животного происхождения, широко используются в медицинской промышленности и медицине. Они применяются для приготовления питательных и диагностических сред, для изготовления ряда лечебных сывороток и вакцин. Протеиназы различной степени очистки используются в качестве лекарственных препаратов для регулирования процессов свертывания крови, при лечении воспалительных процессов, для восполнения недостатка ферментов в организме и т. д.

2.1 Источники получения протеиназ

Протеолитические ферменты синтезируются практически всеми живыми существами. Эти ферменты очень широко распространены в природе. В промышленных целях как источник получения протеиназ используются животные ткани, растения и микроорганизмы. Животными тканями для получения протеиназ является собираемое на мясокомбинатах ферментное сырье, состоящее из поджелудочной железы и слизистой оболочки желудка. Из растений промышленный интерес представляют плоды дынного дерева, побеги и листья инжира и отходы переработки ананасов.

Наиболее широким и перспективным источником протеиназ являются микроорганизмы. Активными продуцентами протеиназ являются бактерии, микроскопические грибы и актиномицеты. Можно назвать сотни микроорганизмов, принадлежащих к различным таксономическим группам, которые используются при промышленном получении протеиназ. Они чаще всего относятся к родам Bacillus, Aspergillus, Penicillium, Streptomyces, Pseudomonas и некоторые другие. Более подробно о продуцентах будет сказано в разделе, посвященном рассмотрению особенностей производства протеолитических препаратов.

2.2 Механизм действия, свойства и классификация протеиназ

Субстрат. Субстратами для действия протеолитических ферментов являются пептиды и белки. К последним относятся простые белки, состоящие только из аминокислот, их называют протеинами, и сложные белки, в состав которых наряду с белковой частью молекулы входят соединения небелковой природы (углеводы, витамины, жиры и др.) – протеиды. Все эти соединения имеют большую молекулярную массу и сложны по строению.

Пептиды также могут быть субстратом для протеиназ. Они имеют более низкую молекулярную массу, чем белки, и по составу подобны простым белкам. Они могут быть либо продуктами неполного гидролиза белка, либо природными соединениями. Пептиды могут быть синтезированы в лаборатории и использоваться как специфические субстраты в аналитических работах для определения способности ферментов к разрыву вполне определенных пептидных связей.

До начала 50-х годов все протеолитические ферменты по механизму их действия на субстрат подразделялись на две группы: протеиназы и пептидазы. Считалось, что гидролиз белка протекает в две стадии: сначала под действием протеиназ белки гидролизуются до пептидов, а затем на пептиды действуют пептидазы и расщепляют их до аминокислот.

Позднее, в 60-х годах, протеолитические ферменты классифицировали на четыре подкласса. В настоящее время действует новая классификация, по которой протеиназы относятся к третьему классу четвертому подклассу. С тем чтобы исключить путаницу, все ранее существовавшие подклассы были отброшены и по новой классификации первому подклассу в разделе протеолитических ферментов присвоен номер 11 (КФ 3.4.11). Такие сложности в классификации связаны с тем, что катализируемая суммарная реакция одинакова для всех протеолитических ферментов. Причем ферменты не имеют строгой субстратной специфичности в обычном смысле этого слова – подавляющее большинство этих ферментов действует на все денатурированные и на многие нативные белки. По новой классификации протеолитические ферменты были разделены на две основные группы: пептидазы КФ 3.4.11 – 15 и протеиназы – КФ 3.4.21 – 24.

Пептидазы. В первой группе протеолитических ферментов – пептидазах – подразделение по подподклассам осуществляется на основе механизма расщепления пептидных связей в пептидах. К группе ферментов, входящих в 11-й подподкласс (КФ 3.4.11) – α-аминоацилпептидгидролазы – относятся те, которые гидролитически расщепляют первую с N-конца пептидную связь. Группа КФ 3.4.12 – гидролазы пептидиламинокислот или гидролазы ациламинокислот – объединяет ферменты, действующие на первую пептидную связь с С-конца. Ферменты группы КФ 3.4.13 – дипептидгидролазы – гидролизуют дипептиды; групп КФ 3.4.14 – дипептидилпептид гидролазы – и КФ 3.4.15 – пептидилдипептидгидролазы – гидролизуют дипептиды соответственно с N- и С-конца. С 16-го до 20-го подподкласса в номенклатуре сделан пропуск с учетом будущих открытий ферментов, гидролизующих дипептиды.

Протеиназы. Вторая группа протеолитических ферментов – протеиназы – имеет четыре подподкласса (21 – 24), в котором все ферменты подразделяются в зависимости от особенностей механизма катализа, установленного по функционированию активного центра фермента, а также влияния рН на его активность. Специфичность к субстрату рассматривается лишь с позиции идентификации индивидуальных ферментов в пределах каждой из групп.

Сериновые протеиназы. К подподклассу 3.4.21 относятся протеиназы, для которых характерно наличие в каталитическом центре триады аминокислот: аспарагиновая кислота, гистидин и серии. В этот подподкласс внесены многие хорошо изученные протеийазы животного происхождения (химотрипсин, трипсин, тромбин, плазмин, эластаза и др.) и некоторые микробные протеиназы.

Тиоловые протеиназы. К подподклассу 3.4.22 относятся протеиназы, имеющие в активном центре SH-группу цистеина.

В подподкласс 3.4.22 вошел ряд важных протеиназ растительного происхождения, такие как папаин, фицин, бромелаин, химопапаин, и некоторые микробные протеиназы.

Кислые протеиназы. Они входят в подподкласс (3.4.23) и имеют оптимальный рН ниже 5, в каталитическом акте у этих ферментов участвуют остатки дикарбоновых аминокислот. Наиболее широко известны из этого подподкласса пепсин, катепсин и ряд кислых протеиназ грибного происхождения. В последний под подкласс (3.4.24) входят протеиназы, содержащие ионы металлов. В основном это различные микробные нейтральные протеиназы и некоторые протеиназы животного происхождения.

В классификации и номенклатуре протеолитических ферментов выделена ещё одна, третья группа протеиназ, которые включены в подподкласс 3.4.99. Это протеиназы с неизвестным механизмом катализа. В этот подподкласс внесено 26 ферментов, среди них много микробных протеиназ, но есть протеиназы и животного происхождения. Создание подподкласса 3.4.99 вызвано тем, что многие протеиназы обладают близкой, но не полностью изученной и определенной специфичностью. Они действуют на один и тот же субстрат, однако продукты гидролиза отличаются не только количественно, но и качественно.

Отличительной особенностью многих протеолитических ферментов животного происхождения является то, что они в организме существуют в неактивном состоянии в виде зимогенов, которые только при определенных условиях могут превращаться в активные формы. Это трипсин, химотрипсин, карбоксипептидазы, А и В, пепсины, реннин, катепсины, аминопептидазы, дипептидазы, тромбин, плазмин и др. Многие из данных ферментов получены в кристаллическом виде. Они чаще используются в медицине. Механизм их действия, субстратная специфичность, механизм ингибирования и активации подробно изучены. Имеются данные о строении активного центра, а для некоторых протеиназ известна и структура самого фермента. Также глубоко и всесторонне изучены основные протеиназы растительного происхождения: папаин, фицин, бромелаин, химопапаин, которые за рубежом широко применяются в медицине и пищевой технологии.

2.3 Получение микробных протеиназ

В Номенклатуру и классификацию ферментов внесено большое количество протеолитических ферментов микробного происхождения, которые относятся к различным подподклассам: 3.4.11 (7 ферментов), 3.4.13(5), 3.4.15(1), 3.4.16(1), 3.4.17(5), 3.4.21(4), 3.4.22(3), 3.4.23(1), 3.4.24(4) и 3.4.99(4). Необходимо отметить, что часто под одним номером находится очень много ферментов, получаемых из различных источников, но имеющих сходные свойства. Так, в подподклассе 3.4.21.14 представлена целая серия микробных протеиназ, среди продуцентов которых отмечаются Bacillus subtilis, E. coli, щелочная протеиназа из культур рода Aspergillus, Tritirachium album, Arthrobacter, Pseudomonas aeruginosa, Malbranchea pulchella, Streptomycer rectus, Candida lipolytica и др. Под номером 3.4.23.6 также объединено много ферментов, источниками которых являются микроорганизмы, в основном относящиеся к грибам родов: A. oryzae, A. terricola, A. saitoi, A. niger, P. janthinellum, R. chinensis, M. pusillus, M. miehei, Endothia parasitica, Candida albicans, Saccharomyces carlsbergensis, Rhodotorula glutinis, Physarum polycephalum и др. Все микробные металлопротеиназы объединены под номером 3.4.24.4. Они выделены из культур родов: Streptomyces, Sarcina, Micrococcus, Staphylococcus, Bacillus, Aeromonas, Pseudomonas, Escherichia, Aspergillus, Myxobacter, Serratia.

Однако в промышленности чаще всего получают комплекс протеолитических ферментов, достоинства которого определяются с учетом последующего применения ферментного препарата. Суммарная протеолитическая активность такого препарата определяется на соответствующем субстрате: гемоглобине, желатине, растительном белке, эластине, коллагене и т. д.

2.3.1 Технологические схемы производства микробных протеиназ

Технологические схемы производства микробных протеиназ (см. рис. 1 и 5) отличаются друг от друга прежде всего на первой стадии получения микробной культуры продуцента, на стадиях выделения различия меньше.

2.3.2 Продуценты

В качестве продуцентов протеолитических ферментов при глубинном культивировании в промышленных условиях используют бактерии в основном рода Bacillus, реже – актиномицеты и микроскопические грибы. Способность к образованию протеолитических ферментов отмечается практически у всех известных микроорганизмов, так как роль этих ферментов в регуляции жизненных функций организмов очень велика. Протеолитические ферменты в подавляющем большинстве случаев являются внеклеточными.

2.3.3 Регуляция синтеза протеиназ

В самом общем виде гипотетический механизм регуляции биосинтеза внеклеточных протеаз у микроорганизмов представлен на рисунке 14. Авторы этой модели, основываясь на данных литературы и собственных исследованиях, предполагают, что иРНК-экзопротеазосинтезирующая система безуспешно конкурирует с системами других РНК вследствие низкого сродства специфических факторов инициации или РНК-полимеразы с участком инициации на экзобелковом гене. Известно, что синтез РНК контролируется либо соотношением ненагруженных и аминоацилированных тРНК (при этом свободные тРНК являются репрессорами синтеза), либо действием гуанозинтетрафосфата (ppGpp), который образуется при аминокислотном голодании и подавляет биосинтез РНК. Суть предлагаемой модели заключается в следующем. Присутствие в среде в достаточном количестве всех необходимых аминокислот и других источников углерода, азота и серы позволяет поддерживать внутриклеточный пул микроорганизма на высоком уровне. При этих условиях клетка осуществляет интенсивный синтез нетранслируемых РНК и иРНК для внутриклеточных белков. В результате содержание свободных факторов инициации РНК-полимеразы, которые могут принять участие в синтезе иРНК экзопротеаз, незначительно. Вероятно, этим объясняется низкая частота транскрипции иРНК экзопротеаз и, следовательно, низкий уровень образования внеклеточных протеаз, например, в начале роста культуры на такой сбалансированной среде (левая сторона схемы).

Истощение среды в процессе роста культуры по одному или нескольким субстратам приводит к снижению уровня пула внутриклеточных свободных аминокислот, что значительно снижает синтез РНК. В результате освобождаются РНК-полимераза и факторы инициации транскрипции РНК. Увеличиваются частота инициации иРНК экзопротеаз и соответственно синтез внеклеточных протеолитических ферментов (правая сторона схемы). При наличии в среде белков экзопротеазы расщепляют их до пептидов и аминокислот, которые поступают в клетку, пополняя ее пул. Аминокислоты утилизируются клеткой активно и являются лимитирующим субстратом. Поступающие в клетку аминокислоты могут полностью удовлетворить ее потребности, т. е. снять лимитирование по этому субстрату, что приведет к временному торможению биосинтеза экзопротеаз и т. д. Иными словами, имеет место механизм контроля синтеза экзопротеаз по типу метаболитной репрессии. Можно предположить, что регуляторное воздействие субстратов на биосинтез экзопротеаз проявляется на уровне транскрипции. Известно, что пул иРНК поддерживает синтез протеаз в течение нескольких часов.

Глубинным способом культивируют многие продуценты протеолитических ферментов. Для производства нейтральных и щелочных протеиназ используют спороносные бактерии и актиномицеты, для получения кислых – микроскопические грибы.

Наиболее широко в нашей стране применяются штаммы бактерий, относящиеся к видам Bacillus subtilis и В. mesentericus, на основе которых выпускаются препараты протосубтилин и протомезентерин разной степени очистки, предназначенные для самых различных отраслей – от пищевых технологий до использования в моющих средствах и сельском хозяйстве.

2.3.4 Питательные среды и условия культивирования

При конструировании оптимальных питательных сред для каждого продуцента изучаются его физиология, потребность в источниках N, С и других соединениях. Содержание сухого вещества в питательной среде в зависимости от продуцента может изменяться от 6 до 20 %. Питательные вещества могут вноситься в среду сразу или дробно по мере потребления из среды лимитирующего компонента. Оптимальный состав среды устанавливается либо путем длительного изучения особенностей биосинтеза ферментов микроорганизмом, либо с использованием математических методов планирования эксперимента.

Способ экспериментального конструирования питательной среды можно продемонстрировать на примере Bacillus subtilis 103 (табл. 3,).

Культивирование проводилось на модифицированной среде Номура следующего состава (в %): картофельный крахмал – 2; двузамещённый цитрат аммония – 3; КСl – 0,15; MgSO4 – 0,05; СаС12 – 0,01; экстракт соевых бобов – 1,0. Если в составе среды изменять источник минерального азота (см. табл. 2.37), то биосинтез протеолитических ферментов будет заметно изменяться, особенно, если соль кислая, например NH4NO3. При потреблении аммонийного азота в среде накапливаются ионы азотной кислоты и среда резко подкисляется, и, хотя рост культуры и происходит, биосинтеза протеиназ не наблюдается. Если взять двузамёщенный фосфат аммония за контроль, то при изучении влияния различных источников органического азота для этого же штамма (табл. 4) оказалось, что уровень рН меняется меньше, чем с неорганическим азотом, и только в одном случае – с глютеном – биосинтез протеолитических ферментов ниже контрольного. Кроме того, введение в состав среды помимо (NH4)2HPO4 (1,2 %) кукурузного экстракта (0,8 %) и пивных дрожжей (0,4 %) позволило получить активность в культуральной жидкости до 1 300 ед. ПС/мл, т. е. почти в 20 раз больше контроля.

Экспериментальный способ оптимизации сред приемлем, но он очень длителен и не всегда оправдан, так как для того, чтобы учесть взаимовлияние отдельных компонентов при изменении их соотношения в среде, необходимо исследование многочисленных вариантов. Проще и целесообразнее вести такие исследования на основе математических методов планирования эксперимента.

Таким образом, способность бактерий образовывать внеклеточные протеиназы повысилась почти в 30 раз. Такие высокие показатели удалось достигнуть благодаря предварительной подработке некоторых компонентов сред, что убыстрило рост культуры и повысило её продуктивность. Подработка компонентов среды является эффективным и весьма распространенным приемом в технологии ферментных препаратов.

2.3.5 Выделение ферментов

На основе культуральной жидкости, содержащей внеклеточные протеиназы, можно получить ферментные препараты различной степени очистки, используя разнообразные методы (см. рис. 1) – начиная от высушивания распылением готовой культуральной жидкости и до методов получения высокоочищенных ферментных препаратов и кристаллических протеиназ.

В таблице 4 представлены основные этапы выделения высокоочищенной протеиназы из технического препарата Г3х. Эта схема позволяет получить с высоким выходом (до 22 %) очищенный препарат внеклеточной нейтральной протеиназы из В. subtilis, которая относится к металлопротеиназам.

Дальнейшие исследования протеолитических ферментов этого микроорганизма позволили установить в них четыре компонента, которые различались между собой по многим физико-химическим характеристикам (табл. 4), особенно по оптимуму рН. Из таблицы 6 видно, что протеиназа II обладает широким диапазоном действия в интервале рН от 7,5 до 11, протеиназа IV является сильнощелочной и т. д.

Наряду с этим очень продуктивным штаммом в промышленности всё больше используются другие бактериальные продуценты нейтральных и щелочных протеаз, которые являются мутантными вариантами или культурами, отобранными в процессе длительной естественной селекции. Среди промышленных бактериальных штаммов можно назвать: В. cereus, В. mesentericus, В. licheniformis (продуцент препарата субтилизин Карлсберга), В. amyloliquefaciens, В. stearothermophilus, В. subtilis (продуценты промышленных препаратов субтилизин BPN и субтилизин Novo) и некоторые другие.

Среди микроорганизмов – продуцентов протеиназ не менее важное место, чем бактерии, занимают актиномицеты и микроскопические грибы. Актиномицеты образуют внеклеточные протеиназы в значительных количествах, но они сравнительно редко используются в промышленных условиях. Очень многие актиномицеты одновременно с протеиназами образуют большое количество внутриклеточных антибиотиков, поэтому имеется возможность одновременно организовать два производства: антибиотиков – из биомассы продуцента и протеолитических ферментов – из жидкой фазы культуры. По такому принципу начиная с 60-х годов в Японии получают протеиназы на основе производства стрептомицина при промышленном культивировании Streptomyces griseus. Протеазы S. griseus получают из фильтрата глубинной культуры путем избирательной сорбции катионообменными смолами. Протеаза после элюции и дальнейшей очистки очищается в 22 – 25 раз и известна на мировом рынке под названием проназы. Проназа является комплексным препаратом, состоящим, по данным различных авторов, из 11 – 13 протеаз: четырех нейтральных, грех щелочных протеиназ и 3 – 5 аминопептидаз и карбоксипептидаз. Это стабильный ферментный препарат, обладающий широкой специфичностью и способностью глубоко (на 70 – 90 %) гидролизовать субстрат до аминокислот. Только кератин и фиброин шелка с трудом гидролизуются проназой. Проназа также гидролизует различные пептиды, амиды и эфиры аминокислот. Она растворима в воде, слабых солевых растворах, водных растворах ацетона и спиртов с концентрацией не выше 50%. Оптимальный рН лежит в щелочной зоне – от 8 до 9; при рН ниже 4 и выше 10 протеазы инактивируются. Стабилизируется проназа ионами кальция, нейтральные протеиназы и пептидазы проназы являются металлоферментами. Пептидазы ингибируются ЭДТА, причем в присутствии ионов кальция и кобальта этот эффект снимается.

Препараты проназы широко используются в различных отраслях промышленности, особенно при щелочных значениях рН. Препараты прекрасно хранятся при комнатной температуре и полностью сохраняют свою активность в течение 3 и более лет. Препараты проназы содержат ферменты, очень близкие по механизму своего воздействия на субстрат к трипсину и химотрипсину. Поэтому в литературе можно встретить для трипсиноподобных протеиназ проназы с различными названиями: протеиназа В, БАЭЭ-гидролаза; трипсин S. griseus, трипсин проназы и т. д. Протеиназы проназы со свойствами, близкими к химотрипсину, в литературе называются: протеиназа С, протеаза А, n-нитрофенилацетатгидролаза 1 и 2, фракция В, эластазоподобный фермент, эндопептидаза В, химотрипсин проназы и др. Следует отметить, что химотрипсинподобный фермент S. griseus обладает высокой эластазной активностью. Вероятно, это комплексный фермент, имеющий в своем составе фрагмент эластазного фермента. Наличие в препаратах проназы пептидаз, вероятно, способствует более полному расщеплению белков и пептидов до аминокислот.

Микроскопические грибы очень длительное время использовались для синтеза нейтральных и особенно кислых протеиназ. Наиболее часто для этих целей применялись различные виды аспергилловых грибов: A. oryzae, A. flavus, A. fumigatus, A. terricola, A. sojae, P. chrysogenum, Monilia sitophila. Эти микроорганизмы образуют протеазы, зона действия которых лежит в интервале рН от 4 до 10 с проявлением максимальной активности при рН, близком к нейтральному. Большой интерес представляют продуценты видов: A. awamori, A. saitoi, Rhizopus javanicus, Rh. pygmaues, Penicillium expansum, P. sponolasum и др., которые образуют кислые протеиназы с оптимальным рН 2,0 – 2,5. Все кислые протеиназы по механизму воздействия на субстрат достаточно близки, но пока нет стройной гипотезы, объясняющей существо протекающей реакции и её механизм.

За рубежом выпускаются кислые пепсиноподобные протеиназы, используемые для гидролиза белков соевых бобов, для хлебопечения и в медицине для улучшения пищеварения. Наиболее широко для производства кислых пепсиноподобных внеклеточных протеиназ используются Aspergillus saitoi, Rhizopus chinensis и Penicillium janthinellum. Схема получения на основе этих культур препаратов классическая и особых отличий не имеет.

Подводя итог по характеристике протеолитических ферментов, следует подчеркнуть, что технология этих препаратов освоена наиболее широко. Это многотоннажное производство, объемы которого превышают по денежному выражению реализуемой продукции почти в 2 раза сумму реализации всех непротеолитических ферментов. Причем доля микробных протеаз составляет 1/2 общего объёма выпускаемых протеолитических ферментов. С учетом того, что из года в год область применения протеаз расширяется и объемы выпускаемой продукции возрастают, можно сказать, что это почти самое крупномасштабное производство в технологии ферментных препаратов. Проведены большие исследования протеаз, этому вопросу посвящены обширные работы, обзоры и монографии. В данном разделе книги сделана попытка лишь слегка коснуться основных особенностей производства протеолитических ферментных препаратов и подчеркнуть те стороны технологии, которые требуют ещё изучения и совершенствования.

2.4 Производственные стоки

Спуск ливневых и производственных сточных вод в канализационную сеть может проводиться только в соответствии с санитарными нормами промышленных предприятий («Санитарные нормы проектирования» СНиП II –32–74). Спуск воды из производственных корпусов должен осуществляться по трём отдельным канализационным устройствам: для отработанных чистых производственных вод (конденсатор, холодильники и т. п.); для загрязненных промышленных стоков; для фекально-хозяйственных вод. Условно чистые производственные воды должны быть предельно регенерированы с целью их повторного использования в производстве, и только в исключительных случаях допускается сбрасывание этих вод в канализацию. Производственные сточные воды, содержащие кислоты или щелочи, должны нейтрализоваться, после чего разрешается спуск их в заводскую сеть фокально-хозяйственной канализации. Спуск фекально-хозяйственных и загрязненных производственных сточных вод в поглощающие колодцы и буровые скважины запрещен.

Производственные сточные воды перед сбросом из цеха в наружную канализацию необходимо подвергать первичной очистке с целью извлечения, регенерации и утилизации ценных продуктов, максимального снижения концентрации органических веществ и минеральных солей. Следует проводить извлечение пожаро- и взрывоопасных газов, масел, смол, токсических веществ, которые не могут быть удалены при последующей биологической очистке сточных вод.

Сточные воды предприятий ферментной промышленности должны иметь следующие характеристики (в мг/л): химическая потребность в кислороде (ХПК) – не более 600; биохимическая потребность в кислороде (БПКполн) – не более 410; общий азот – 150; аммонийный азот – 30; азот нитратов – 33; фосфор – 1,3; крупнодисперсные вещества – 500; мутность незначительная; рН 7,0. Инфицированная культуральная жидкость перед спуском в канализацию должна быть простерилизована или прокипячена в течение 1 ч.

Биомасса продуцента при глубинном культивировании, если ее концентрация в сточных водах не превышает допустимой нормы по мутности и взвеси, может быть после стерилизации также присоединена к промышленным канализационным стокам.

При ферментных заводах, где отсутствует общегородская канализация и сброс сточных вод осуществляется непосредственно в водоемы, предусматривается строительство очистных сооружений для промышленных и хозяйственных стоков. Условия, место сброса сточных вод, метод и степень очистки их подлежат согласованию с Государственной санитарной инспекцией и Государственной инспекцией по охране рыбных запасов

Страницы: 1, 2