РУБРИКИ

Использование полиэлектролитных микрокапсул с целью разработки систем адресной доставки биологичеcки...

   РЕКЛАМА

Главная

Зоология

Инвестиции

Информатика

Искусство и культура

Исторические личности

История

Кибернетика

Коммуникации и связь

Косметология

Криптология

Кулинария

Культурология

Логика

Логистика

Банковское дело

Безопасность жизнедеятельности

Бизнес-план

Биология

Бухучет управленчучет

Водоснабжение водоотведение

Военная кафедра

География экономическая география

Геодезия

Геология

Животные

Жилищное право

Законодательство и право

Здоровье

Земельное право

Иностранные языки лингвистика

ПОДПИСКА

Рассылка на E-mail

ПОИСК

Использование полиэлектролитных микрокапсул с целью разработки систем адресной доставки биологичеcки...

Использование полиэлектролитных микрокапсул с целью разработки систем адресной доставки биологичеcки...

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫХ МИКРОКАПСУЛ С ЦЕЛЬЮ РАЗРАБОТКИ СИСТЕМ АДРЕСНОЙ ДОСТАВКИ БИОЛОГИЧЕКИ-АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ НА ПРИМЕРЕ ИММОБИЛИЗАЦИИ ХИМОТРИПСИНА

 

Т.Н. Бородина, Е.А. Марквичева, Л.Д. Румш, С.М. Кунижев, Г.Б. Сухоруков

 

ВВЕДЕНИЕ

Разработка рецептурных форм для лекарственных средств, в которых качества активных ингредиентов сохраняются длительное время – важная задача, так как многие БАВ не рассчитаны на длительное пребывание в организме – они быстро выводятся или метаболизируют. Также их полезные свойства утрачиваются под воздействием кислорода, УФ – облучения и перепадов температуры. Кроме того, некоторые весьма важные компоненты могут нейтрализовать оздоровительное действие других компонентов, а в некоторых случаях образовывать с ними принципиально вредные для организма продукты. В связи с этим БАВ используются с недостаточной эффективностью, что приводит к снижению лечебного свойства конечного лекарственного средства.

Именно поэтому, все больше ученым приходится задумываться не только над поиском новых биорегуляторов, но и над созданием более совершенных форм уже известных биологически активных препаратов и задачей доставки этих препаратов в организм, регулирования скорости их действия и времени пребывания в организме. Природные полимеры, с этой точки зрения, представляют уникальную возможность для создания новых средств доставки БАВ. Широкое применение природных полимеров обусловлено их биосовместимостью, способностью к биодеградации, низкой токсичностью. В настоящее время к перспективным формам доставки различных биорегуляторов (ферментов, гормонов, витаминов, активаторов и ингибиторов различной природы) к тканям и органам относят липосомы, векторы, наночастицы, такие как полиэлектролитные микрокапсулы.

Включение белков в полимерные сферы и капсулы представляет большой научный и практический интерес [3]. Внимания заслуживают публикации по капсулированию белков в полиэлектролитные (ПЭ) частицы. Ступенчатое нанесение противоположно заряженных полиэлектролитов на матрицу, в качестве которой могут выступать твердые частицы различного размера, позволяет проводить иммобилизацию в мягких условиях и в водных растворах [4].

На основе полиэлектролитных комплексов (ПК) могут быть созданы эффективные системы с иммобилизованным ферментом, обладающим свойством саморегулирования [5]. Ранее было предложено [6] использовать ПК в качестве депо антигепариновых веществ. Антигепариновые вещества, представляющие собой растворимые катионные полиэлектролиты, являются чрезвычайно токсичными. Их токсичность не проявляется на фоне гепарина благодаря образованию ПК гепарин-поликатион. Поэтому передозировка антигепариновых препаратов представляет значительную опасность. Использование этих веществ в составе ПК позволяет избежать данного побочного эффекта.

В качестве матриц для ПК  используются коллоидные частицы с диаметром от десятков нанометров [7] до десятков микрон [8;9]. Круг использованных коллоидных частиц разнообразен. Среди них латексные полистирольные и меламинформальдегидные частицы [10;11], неорганические карбонатные матрицы [12], кристаллы органических красителей [13;14], микрочастицы из полигидроксикарбоновых кислот [8], интактные клетки [15], белковые агрегаты [16], микроагрегаты ДНК [17]. В данной работе были использованы CaCO3 ядра, которые, на наш взгляд, являются оптимальными при работе с БАВ, т.к. растворяющим агентом для них служит ЭДТА и процесс растворения происходит в мягких условиях при физиологических значениях рН.

Для формирования полиэлектролитной оболочки на коллоидных частицах методом ПЭ адсорбции используются как синтетические, так и природные полиэлектролиты. В качестве последних применялись хитозан и хитозансульфат [18;19], протамин и декстран сульфат [20] и другие. В данной работе были использованы альгинат натрия и поли – L- лизин, которые являются биосовместимыми и биодеградируемыми полимерами. Основным фактором, определяющим эффективность микрокапсул, является проницаемость их оболочек для пищеварительных соков и других биологических жидкостей, а также для содержащихся в них лекарственных веществ. С этой целью было исследовано влияние протеолитического фермента – трипсина на полученные микрочастицы.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В работе использовали α-химотрипсин, «Fluka, Biochemika» (Германия); поли-L-лизин (PLL)(150-300 кДа), «Fluka», США; альгинат натрия средней вязкости (Alg), «Sigma» (Германия); трипсин (ТР) "Sigma" (Германия); N- Бензоил-L-тирозин (ВТЕЕ), "Sigma" (Германия); этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), «Sigma» (Германия), ТРИС-буфер, "Sigma" (Германия); хлорид натрия, соляная кислота, гидроксид натрия.

1. Получение микрочастиц карбоната кальция

Эквивалентный объем (15 мл) 0,33 N водного раствора Na2CO3 быстро приливали при перемешивании (400-900 об/мин) к 0,33 N водному раствору CaCl2.. После перемешивания в течение 60 сек, суспензию образовавшихся частиц оставляли на 5-7 минут до полной кристаллизации карбоната кальция. Далее осадок CaCO3 промывали 50 мл воды и фильтровали. Отмывку повторяли 3 раза. Последний раз микрочастицы промывали спиртом или ацетоном, после чего фильтр помещали под нагревательную лампу и сушили 1,5 час при 50-60 оС. Сухие микрочастицы CaCO3 хранили в закупоренной емкости при комнатной температуре.

2. Включение ХТР в CaCO3 микрочастицы методом адсорбции в порах

50-100 мг CaCO3 микрочастиц диаметром 3-5 микрон суспендировали в 1 мл раствора фермента (5-10 мг/мл) в воде. После инкубации на шейкере или качалке в течение 2 часов, микрочастицы осаждали центрифугированием (1000 об/мин, 5 мин) и отделяли супернатант. Далее частицы оставляли на 10 часов в холодильнике, центрифугировали (1000 об/мин, 5 мин), отбирали супернатант. После этого, частицы дважды промывали водой (1мл), используя центрифугирование (1000 об/мин, 5 мин)/ресупендирование.

3. Получение полиэлектролитных микрокапсул

Капсулы получали на CaCO3 частицах с диаметром 3-5 мкм последовательной адсорбцией Alg (2 мг/мл) и PLL (2 мг/мл) в 0,02 N NaCl. Нанесение каждого слоя полиэлектролитов проводили в течение 15 минут, затем частицы центрифугировали и дважды промывали в 0,02 N NaCl. При агрегации частиц между собой в процессе адсорбции ПЭ, суспензию микрочастиц подвергали обработке ультразвуком (максимальная мощность) в течение 1-3 сек. После нанесения 3-ех слоев Alg и 3–ех слоев PLL, CaCO3- частицы растворяли 0,2М раствором ЭДТА, рН 7,0. После полного растворение карбонатной матрицы, микросферы промывали в воде 3 раза (время инкубации 3-5 минут) и хранили в виде суспензии при 4 оС.

4. Определение содержания белка в микрочастицах и растворах

Определения концентрации белка в растворах проводили спектрофотометрически. Для этого в кювету на 1,5 мл вводили 1 мл раствора белка и измеряли оптическую плотность при 280 нм. Исследуемые растворы были разбавлены, с учетом коэффициента экстинкции для каждого белка, таким образом, чтобы значение оптической плотности не превышало 2. Калибровочную кривую строили с использованием того же белка, который использовали для получения микрочастиц. Эффективность включения (иммобилизации) белка определяли как отношение оптической плотности в исходном растворе (Dисх) к значению в супернатанте после сорбции(Dсорб).

5. Измерение протеолитической активности ХТР

Для изучения протеолитической активности иммобилизованного ХТР в водной среде (0,08 М ТРИС-буфер, рН 7,8, содержащий 0,1М CaCl2), использовали следующую методику. 40 мкл раствора ХТР или суспензии микросфер с ХТР добавляли в кювету на 1,5 мл, содержащую 0,15 мл 0,08 М ТРИС-буфера, рН 7,8 и 0,14 мл 0,00107 М BTEE в 50% растворе метанола (63 мл абсолютного метанола в 50 мл воды). Прирост оптической плотности регистрировали спектрофотометрически при длине волны 256 нм в течение 5 минут. При этом каждую минуту кювету встряхивали, чтобы избежать осаждения микросфер с включенным белком. Таким образом, прирост оптической плотности был обусловлен накоплением продукта ферментативного гидролиза.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

1. Получение микрокапсул с ХТР на основе CaCO3-частиц

Полиэлектролитные микрокапсулы были получены ступенчатой адсорбцией [5] противоположно заряженных Alg и PLL на твердых CaCO3-частицах. Впервые микрочастицы из карбоната кальция были получены и применены в качестве деградируемой матрицы для получения ПЭ микрочастиц в работе [10]. Непосредственное взаимодействие эквимолярных растворов карбоната натрия и хлорида кальция при перемешивании приводит к кристаллизации малорастворимой соли CaCO3. Образующиеся в результате микрочастицы имеют сферическую форму и размер несколько микрон (микрометров?).  Микрофотографии таких частиц, полученные с помощью сканирующего электронного микроскопа, представлены на рисунке 1. На фотографии можно видеть внутреннюю канало-подобную структуру частиц. Формирование такого рода архитектуры вызвано специфическим процессом роста частиц [21].

Для получения микросфер (Alg/PLL)3, в качестве агента для растворения CaCO3 матрицы, была использована ЭДТА (рН 7,0). Использование CaCO3 частиц позволяет проводить процесс микрокапсулирования в физиологически оптимальных значениях рН, что особенно важно для иммобилизации БАВ, в частности – белков. Первым ПЭ наносился Alg в силу отрицательного заряда CaCO3 микрочастиц (ξ-потенциал поверхности составил –12,2±2,5 мВ). В процессе последовательной адсорбции макромолекулы ПЭ проникают в поры CaCO3 микрочастиц, так как размер пор (30-90 нм) в несколько раз больше размера макромолекул ПЭ. Таким образом, во внутренних каналах микрочастиц происходит формирование интерполиэлектролитного комплекса. После растворения CaCO3 матрицы ПЭ комплекс остается стабильным [21].

Размер микросфер в растворе соответствовал размеру исходной матрицы - CaCO3 микрочастиц. Данный факт подтверждается наблюдениями за микрочастицами в процессе удаления карбонатной матрицы (оптическая микроскопия). На рисунке 2 представлены фотографии CaCO3 микрочастиц (А) и ПЭ микросфер, полученных на их основе (Б). Сохранение микросферами формы и размера, использованных для их получения матриц, говорит о придании полиэлектролитным  «каркасом» существенной прочности ПЭ микросферам, в том числе по отношению к осмотическому давлению, возникающему при растворении твердой CaCO3 матрицы. Это особенно ценно, так как «осмотический шок» при растворении матрицы, покрытой оболочкой из ПЭ комплекса, вызывает увеличение размера образующихся микросфер, состоящих из ПЭ оболочки, или даже деформацию и разрушение таких ПЭ микрокапсул [22].

Известно, что адсорбция белков из раствора на твердой поверхности является результатом нескольких основных процессов [23]: а) электростатического взаимодействия между белком и поверхностью; б) взаимодействия между молекулами белков; в) изменения структуры белка. Таким образом, контакт белка с твердой поверхностью определяется как межмолекулярными, так и внутримолекулярными силами.

В процессе получения микрокапсул наносилось по 3 слоя каждого ПЭ, исходная концентрация ХТР составляла 5 мг/мл и 10 мг/мл. Анализ полученных результатов показал, что процент сорбции на 100 мг частиц при начальной концентрации 5 мг/мл составил 80% (4 мг/мл ХТР), 10 мг/мл – 41% (4,1 мг/мл ХТР). ? Включение ХТР в CaCO3 микрочастицы проводили методом адсорбции в порах (АП). О равномерном распределении фермента ....

2. Изучение активности иммобилизованного ХТР и биодеградации микрокапсул

Иммобилизованный в ПЭ микрокапсулы, ХТР практически полностью сохраняет свою активность (86±9% по сравнению с нативным ферментом).Данные, полученные в результате сравнения гидролиза субстрата нативным ХТР и ХТР, включенным в ПЭ микрокапсулы, представлены в виде графика на рисунке 3. Изменение оптической плотности во времени обусловлено накоплением продукта ферментативного гидролиза. Полученные данные позволяют сделать следующие выводы: а) в процессе гидролиза отсутствуют стерические затруднения при диффузии субстрата через оболочку к молекулам иммобилизованного ХТР; б) равномерное распределение фермента в частицах при адсорбции, способствует практически полному гидролизу субстрата молекулами ХТР; в) при иммобилизации не происходит изменения конформации  активного центра молекул фермента.

Комлексообразование ферментов с ПЭ приводит к  снижению  активность или не оказывает  влияния, которое зависит от природы реагирующих веществ и условий. Так, авторы работы [16] по иммобилизации лактатдегидрогеназы в сетку ПЭ комплекса, отмечают семикратное падение активности иммобилизованного фермента. В нашем случае, включение белков в ПЭ микрокапсулы, способствует сохранению их активности и получению стабильных при хранении препаратов.

С целью изучения проницаемости оболочек к действию протеолитических ферментов было исследовано влияние растворов ТР на ПЭ микрокапсулы. Как известно, ТР входит в состав секрета поджелудочной железы и является эндопептидазой, т.е. он расщепляет пептидные связи, образованные основными аминокислотами, такими, как лизин [24]. Были использованы следующие концентрации ТР: 0,05%, 0,1% и 0,2%. Результаты показали, что микрокапсулы растворились в течение часа (оптическая микроскопия). С целью доказательства сохранения активности ХТР, после биодеградации микрокапсул был проведен гидролиз субстрата полученными растворами. Спектрофотометрическое изучение показало, что ХТР сохранил активность после разрушения ТР. Результаты этого исследования представлены на рисунке 4. Прирост оптической плотности, обусловленный накоплением продукта ферментативного гидролиза, свидетельствует о сохранении активности ХТР после разрушения ПЭ микрокапсул.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные эксперименты позволяют сделать вывод, что в качестве исходной матрицы для получения ПЭ микрокапсул, содержащих ХТР, наиболее приемлемыми являются CaCO3 микрочастицы. Использование последних позволяет проводить процесс микрокапсулирования в физиологически оптимальных значениях рН на всех этапах. Это открывает большие возможности для иммобилизации широкого спектра белков с сохранением их активности. Кроме того, при растворении твердой CaCO3 матрицы, микросферы сохраняют размер и форму, что свидетельствует об их существенной прочности, в том числе по отношению к осмотическому давлению. Полученные микрочастицы с узким распределением по размерам (3-5 мкм) имеют пористую структуру, что позволяет иммобилизовать на их основе различные белки методоми физической сорбции. Высокое содержание по белку (80% в случае исходной концентрации ХТР 5 мг/мл), а также биосовместимость и биодеградация полученных ПЭ микросфер, позволяют использовать их в качестве систем доставки включенного препарата.

Экспериментальные данные, полученные при изучении активности иммобилизованного ХТР, свидетельствуют об отсутствии стерических затруднений при диффузии субстрата к молекулам фермента, равномерном распределении белка в частицах при адсорбции, сохранении конформации молекул фермента при иммобилизации. Результаты позволяют сделать вывод о сохранении активности и получении стабильных при хранении препаратов БАВ, включенных в ПЭ микрокапсулы.

Разрушение микрокапсул, полученных последовательной адсорбцией PLL и Alg на CaCO3 микрочастицах, под действием фермента поджелудочной железы – ТР, открывает широкие возможности использования полученных препаратов в медицинской биотехнологии. Использование природных и биодеградируемых ПЭ позволит создать микрокапсулы, обладающие такими свойствами, как избирательная проницаемость, контролируемая доставка и высвобождение заключенных в них БАВ, биодеградация, биосовместимость, что позволит расширить тем самым область их потенциального применения.

Полученные результаты будут использованы в дальнейшей работе по исследованию модели поведения микрокапсул при переходе через биологические барьеры для обеспечения адресной доставки БАВ к отдельным органам и клеткам- мишеням.

ЛИТЕРАТУРА

1. Kraut J., (1967) Serine proteases: structure and mechanism of catalysis, Ann. Rev. Biochem, 242(24): 5777-5781.

2. Машковский М.Д,.(1993) Лекарственные средства, М., Медицина, 2: 685.

3. Arshady R., (1999) Microspheres. Microcapsules & Liposomes, London, 1.2.

4. Lvov Y.M., Sukhorukov G.B., (1997) Protein architecture: Assembly of ordered films by means alternated adsorption of opposite charged macromolecules, Membr. Cell. Biol., 11, 277-303.

5. Кабанов В.А., Зезин А.Б, (1984) Водорастворимые нестехиометричные полиэлектролитные комплексы - новый класс синтетических полиэлектролитов, Итоги науки и техники, М.,. Сер. Органическая химия, 5: 131-189.

6. Кабанов В.А, (1994) Физико-химические основы и перспективы применения растворимых интерполиэлектролитных комплексов, Высокомолекулярные соединения, 36(2): 183-197.

7. Mayya S., Schoeler B., Caruso F., (2003) Preparation and organization of nanoscale polyalactrolyte-coated gold nanoparticles, Adv. Funct. Mater., 13(3): 183-188.

8. Shenoy D.B., Antipov A.A., Sukhorukov G.B., Mohwald H., (2003) Layer-by-Layer Engineering of Biocompatible, Decomposable Core-Shell Structures, Biomacromolecules, 4(2): 265-272.

9. Qiu X.P., Leporatti S., Donath E., Mohwald H., (2001) Studies on the drug release properties of polysaccharide multilayers encapsulated ibuprofen microparticles, Langmuir, 17(17): 5375-5380.

10. Sukhorukov G.B., Donath E., Davis S., Lichtenfeld H., Caruso F., Popov V.I., Mohwald H., (1998) Stepwise polyalectrolyte assembly on particles surface: a novel approach to colloid design, Polym. Adv. Technol., 9 (10-11): 759-767.

11. Sukhorukov G.B., Donath E., Lichtenfeld H., Knippel E., Knippel M., Budde A., Mohwald H., (1998) Layer-by-Layer self assembly of polyelectrolytes on colloidal particles, Colloid. Surf.: Physicochem. Ang. Aspects, 137 (1-3): 253-266.

12. Antipov A.A., Shchukin D., Fedutik Y., Petrov A.I., Sukhorukov G.B., Mohwald H., (2003) Carbonate microparticles for hollow polyelectrolyte capsules fabrication, Colloid. Surf.: Physicochem. Ang. Aspects, 224: 175-184.

13. Caruso F., Yang W.J., Trau D., Renneberg R., (2000) Microencapsulating of uncharged low molecular weight materials by polyelectrolyte multilayer self-assembly, Langmuir, 16(23): 8932-8936.

14. Antipov A.A., Sukhorukov G.B., Donath E., Mohwald H., (2001) Sustained release properties of polyelecyrolyte multiplayer capsules, J. Phys. Chem. B, 105(12): 2281-2284.

15. Donath E., Sukhorukov G.B., Mohwald H., (1999) Submicrometric and micrometric polyelectrolyte capsules, Nachrichten Aus Chemie Technik Und Laboratorium, 47(4): 400-405.

16. Бобрешова М, Сухоруков Г.Б., Сабурова Е.А., Елфимова Л.И., Шабарчина Л.И., Сухоруков Б.И. (1999) Лактатдегидрогеназа в интерполиэлектролитном комплексе. Функция и стабильность, Биофизика, 44(5): 813-820.

17. Trubetskoy V.S., Loomis A., Hangstrom J.E., Budker V.G., Wolff J.A., (1999) Layer-by-Layer deposition of oppositely charged polyelectrolytes on the surface of condensed DNA particles, Nucl. Acid Res., 27(15): 3090-3095.

18. Sukhorukov G.B., Donath E., Moy S., Susha A.S., (2000) Microencapsulation by means of step-wise adsorbtion of polyelectrolytes, Microencapsulation, 17(2): 177-185.

19. Berth G., Voigt A., Dautzenberg H., Donath E., Mohwald H., (2002) Polyelectrolyte complex and layer-by-layer capsules from chitosan/chitosan sulfate, Biomacromolecules, 3(3): 579-590.

20. Balabushevitch N.G., Tiorina O.P., Volodkin D.V., Larionova N.I., Sukhorukov G.B., (2003) Loading the Multilayer Dextran Sulfate/ Protamine Microsized Capsules with Peroxidase, Biomacromolecules, 4(5): 1191-1197.

21. Volodkin D.V., Petrov A.I., Prevot M., Sukhorukov G.B., (2004) Matrix Polyelectrolyte Microcapsules: New System for Mocromolecule Encapsulation, Langmuir, 20: 3398-3406.

22. Gao C., Leporatti S., Moya S., Donath E., Mohwald H., (2001) Stability and Mechanical Properties of Polyelectrolyte Capsules Obtained by Stepwise Assembly of Poly(styrenesulfonate sodium salt) and Poly(diallyldimethyl ammonium )Chloride onto Melamine Resin Particles, Langmuir, 17: 3491-3495.

23. Haynes C.A., Norde W., (1994) Globular proteins at solid/liquid interfaces, Colloid Surf. B, 2: 517-566.

24. Кольиан Я., Рем К.-Г., (1998) Наглядная биохимия, М., Мир, 262-263.



© 2000
При полном или частичном использовании материалов
гиперссылка обязательна.