Ионообменная хроматография

Переходя к рассмотрению вариантов истинной хроматографии, полезно ввести понятия «подвижной» и «неподвижной» фаз. Имеется в виду движение фракционируемых молекул вниз по колонке. Подвижную фазу, естественно, составляют молекулы, находящиеся вне гранул. Они движутся вместе с током элюента. Неподвижную фазу — молекулы, находящиеся внутри гранул. Такое разделение имело место и при гель-фильтрации. Там неподвижные в указанном смысле молекулы были таковыми в силу их растворения в неподвижной водной среде, заполнявшей гранулы. Конечно, и в этой среде они совершали броуновское движение, но это не подвигало их к выходу из колонки. С материалом самих гранул они если и взаимодействовали, то чисто механически — наталкиваясь на нити полимера, образующего гранулы.

В случае ионообменной хроматографии, наоборот, неподвижную фазу, в основном, составляют молекулы определенным образом связанные с материалом гранул («сорбированные» на нем). Пористость последних в этом случае выбирают так, чтобы фракционируемые молекулы могли бы практически беспрепятственно проникать в гранулы, заполняя весь их внутренний объем.

Само название ионообменная хроматография указывает на то, что связь молекул с гранулами должна быть ионная. То есть определяться кулоновскими силами притяжения между ионами противоположных знаков, закрепленными на нитях гранул и существующими на поверхности молекул. Слова «закрепленные» и «существующие» наводят на мысль о раз и навсегда фиксированной ситуации. Между тем, гибкость и эффективность метода ионообменной хроматографии опирается как раз на возможность управления этой ситуацией, а вместе с ней и силой связи молекул фракционируемого вещества с матрицей гранул — характером сорбции этих молекул.

Ионогенные группы

Вместо неизменных ионов на нитях матрицы и на поверхностях макромолекул (например белков) располагаются «ионогенные группы», которые в зависимости от условий в окружающей их водной среде (рН, наличие солей) могут проявлять себя либо как открытые, несущие электрический заряд ионы, либо быть нейтрализованными за счет сближения с ними несущих противоположный заряд ионов, например Na+ или С1-, а иногда за счет диссоциации или присоединения протонов Н+.

На поверхности белков ионогенными группами заканчиваются боковые ветви таких аминокислот, как лизин и аргинин или аспарагиновая и глутаминовая кислоты. Диссоциация протона в первом случае и ассоциация во втором нейтрализуют эти группы. Оба эти процесса зависят от концентрации протонов в окружающей водной среде, т. е. от величины рН (соответственно в щелочной или кислой области). Вместо химической модификации, каковой являются оба названных явления, нейтрализация заряда ионогенной группы может происходить и за счет его экранизации противоположно заряженным ионом, подходящим под действием кулоновской силы вплотную к ионогенной группе из окружающей среды. Ковалентной химической связи не образуется. Экранирующий ион в этом случае именуется «контрионом».

Ионогенные группы, способные проявлять свой положительный заряд, именуются «анионитами» — они в какой-то мере подобны аноду в электрической цепи. Группы, открывающие свой отрицательный заряд, соответственно именуются «катионитами». Для модификации нитей хроматографических гранул практика отобрала небольшое число ионогенных групп различной «силы». Наиболее употребимыми для «анионообменников» (хроматографических матриц, несущих аниониты) являются: диэтилами-ноэтил — сокращенное обозначение ДЕАЕ и ди-этил-2-оксипропиламиноэтил сокращенное обозначение QAE. Заметим, что первая из этих групп сравнительно легко может нейтрализоваться химически в щелочной среде за счет потери протона. Вторая — несет положительный заряд при любом значении рН среды и может нейтрализоваться только экранизацией отрицательно заряженным контрионом. В соответствии с этим отличием анионообменники на основе ДЕАЕ именуются «слабыми», а обменники на основе QAE — «сильными».

Аналогично и в случае отрицательных ионогенных групп, «катионообменники» бывают «слабыми» — они несут карбоксиметильные группы и «сильными», которые модифицированы сульфопропильными группами. Сокращенные обозначения этих групп, соответственно, СМ и SP. Сильные катионообменники сохраняют свой отрицательный заряд во всем рабочем биологическом диапазоне значений (рНЗ—11) и могут быть только заэкранированы положительными контрионами.

Что же касается матриц, несущих описанные модификации (в случае фракционирования биополимеров), то это уже знакомые нам гранулы на основе полисахаридов: сефадексы, химически сшитые агарозы и целлюлозы. В их торговых наименованиях присутствуют и название материала матрицы и сокращенного указания ионогенной группы. Например: «ДЕАЕ-сефадекс», «QAE-целлюлоза», «СМ-сефадекс», «SP-сефароза CL» и т. д. В каждом типе предлагается несколько обменников, различающихся между собой размерами гранул и пор.

Матрицы для ионообменной хроматографии при высоком давлении (на основе силикагеля) я оставляю в стороне. Фирма Pharmacia для своей системы быстрой хроматографии белков разработала на основе исключительно однородных по размерам гранул два типа сильных ионообменников: анионообменник под торговым названием «Моно Ф» — активная группа триметиламинометил и катионообменик «Моно S» — активная группа сульфометил .

Теперь полезно будет представить себе некоторые пространственные соотношения. Будем ориентироваться на очистку и фракционирование белков, поскольку это — основная область использования ионообменной хроматографии. Диаметры глобулярных белков (в отличие от их масс) варьируют не очень сильно. Так например, молекула бычьего сывороточного альбумина (М = 69 000) имеет в поперечнике 70 А, а молекула гамма-глобулина (М =150 000) около 100 А. (Ввиду этих цифр я не упоминал матрицы на основе полистирола, поскольку у них размер пор лежит в пределах 5-20 А.)

Пористость матриц, используемых для фракционирования белков, лежит в диапазоне 300-1000 А. В таких порах молекулы белков могут перемещаться столь же свободно, как теннисный мячик в изготовленной из проволоки пространственной сетке с ребром ячейки в 30-40 см.

На поверхности белков могут находиться ионогенные группы аминокислот обоих знаков (все — слабые), отстоящие друг от друга на расстоянии в несколько десятков ангстремов. Ионогенные группы внутри гранул могли бы располагаться теснее, поскольку присоединение по ОН-группам могло бы осуществляться в каждом звене глюкозы. Но это бесполезно, так как с двумя столь близко расположенными группами не смогли бы в силу своих размеров взаимодействовать одновременно две молекулы белка, и невыгодно, поскольку чревато слишком прочным связыванием одной молекулы в нескольких точках. Практика выработала для среднего расстояния между ионогенными группами на одной матрице величину в 10—30 А.

Ионы и контрионы

Еще следует напомнить, что в жидкости, заполняющей поры ионообменника, обязательно присутствуют контрионы. Во-первых, от самого ионообменника, который поступает в распоряжение экспериментатора всегда в нейтральной форме, то есть вместе с контрионами (Na+, K+ или С1- формы). Во-вторых, это контрионы ионогенных групп белков и, наконец, это ионы, присутствующие в элюенте по воле исследователя.

Контрионы, благодаря электростатистическому притяжению, находятся вблизи соответствующих ионов, но не связаны с ними химической связью. Поэтому под воздействием тепловых ударов молекул воды легкие контрионы часто отходят от ионогенных групп на значительные расстояния, а иногда и вовсе отрываются от них (кулоновские силы с расстоянием убывают очень быстро). Но очень скоро эти контрионы либо возвращаются, либо заменяются другими, точно такими же. Когда контрион находится вблизи иона ионогенной группы, он нейтрализует (экранирует) поле его заряда, когда удаляется — для электрического поля иона открывается возможность взаимодействовать с другими ионами, в том числе с ионами, открывшимися на поверхности оказавшейся вблизи молекулы белка.

Если бы обнажение заряда на матрице сопровождалось свечением, а сами мы, превратившись в «супергномов», оказались внутри гранулы ионообменника, то нашим глазам представилась бы волшебная картина мерцания бесчисленного множества разбросанных по всему объему огоньков. (Допустим, что красных, если заряды положительные.) Чем выше концентрация соли в элюенте, тем меньше времени каждый из зарядов ионообменника оставался бы открытым и, соответственно, меньшее число их было бы открыто одновременно — красные вспышки света стали бы короче и число огоньков уменьшилось. Если ионообменник слабый, то общее число ионогенных групп матрицы, участвующих в этом «фейерверке», можно было бы регулировать изменениями рН элюента, нейтрализуя химически часть ионогенных групп.

Теперь дополним нашу воображаемую картину медленно плывущими внутри гранулы крупными молекулами белка. На них тоже вспыхивают огоньки. Но уже двух цветов: красные и синие, так как кроме положительных анионитов на поверхности белка имеются и отрицательные ионогенные группы — катиони-ты. Разумеется для них тоже найдутся контрионы. При изменениях рН среды будет увеличиваться интенсивность свечения одних слабых ионогенных групп белка и одновременно уменьшаться интенсивность свечения других (другого цвета). Ионы соли, находящиеся в элюенте, влияют на электрическую активность незаблокированных за счет рН ионогенных групп белка в соответствии со своими зарядами.

Хроматографическое фракционирование белков

Мы подготовили материал для мысленного рассмотрения процессов закрепления молекулы белка на матрице ионообменника и его освобождения от связи с ней. Для первоначальной фиксации этой молекулы необходимо одновременное осуществление двух или, пожалуй, даже трех условий. Во-первых, белок должен подойти к нити полимера так, чтобы разноименно заряженные ионы на его поверхности и на нити сорбента оказались сближенными до расстояния, на котором эффективно действует кулоновская сила притяжения. Во-вторых (и в-третьих) оба сблизившихся иона должны быть не заблокированы контрионами. Хотя вероятность такого совпадения кажется и небольшой, но число столкновений с нитями ионообменника, которое испытывает каждая молекула белка за единицу времени настолько велико, что практически за несколько минут для каждой из молекул, находящихся внутри гранулы, благоприятная ситуация реализуется хотя бы однажды. Молекула в этот момент окажется связанной с матрицей. Ее поступательное движение прекратится, хотя под тепловыми ударами молекул воды молекула белка будет поворачиваться около единственной точки своей фиксации.

Оторвать макромолекулу белка от матрицы будет нелегко, потому что большая масса обусловит инерционность ее поведения, а также потому, что разнонаправленные импульсы ударов о поверхность белка многих молекул воды будут уравновешивать друг друга. Тем не менее, неизбежно наступит момент, когда равнодействующая этих импульсов окажется достаточно большой для того, чтобы удалить молекулу белка на такое расстояние, где кулоновское притяжение заметно ослабеет — молекула оторвется от матрицы. Если концентрация соответствующих контрионов в окрестностях обоих ионов будет мала и оба они в течение некоторого времени будут «открыты», то есть шанс, что отошедшая недалеко молекула белка за счет броуновского движения вновь сблизится с тем же самым ионом матрицы так, что восстановится ее первоначальная фиксация. Если же концентрация контрионов достаточно велика и хотя бы один из ранее взаимодействовавших ионов окажется заблокированным, белок окончательно оторвется от данной точки матрицы и возобновит свое диффузионное движение до тех пор, пока совпадение благоприятных условий не фиксирует его в новой точке внутри гранулы или пока он не покинет ее пределы и выйдет в окружающий элюент. Впрочем, в тот же момент из элюента в гранулу в процессе диффузии, вероятно, войдет точно такая же молекула белка.

Легко себе представить, что в первые же минуты после внесения смеси белков на колонку для каждого из них независимо установится динамическое равновесие распределения фиксированных и свободных молекул, отвечающее данным значением рН элюента и концентрации соли. А вместе с ним и динамическое равновесие концентраций этих молекул в подвижной и неподвижной фазах. (В отличие от гель-фильтрации, благодаря сорбции на обменнике равновесие концентраций будет сильно сдвинуто в сторону неподвижной фазы.)

После начала элюции свободно текущий элюент будет уносить молекулы, вышедшие из гранул, вниз по колонке. В результате чего динамическое равновесие концентраций в вышележащем слое будет восстанавливаться (на более низком общем уровне) за счет выхода молекул из неподвижной фазы в подвижную. А в нижележащем первоначально «пустом» слое гранул динамическое равновесие концентраций в двух фазах будет создаваться за счет перехода молекул из элюента в гранулы и их сорбции там. С новыми порциями свободного элюента, поступающего на колонку, этот процесс будет продолжаться, перенося все большее число молекул из вышележащего слоя в нижележащий... Таким образом зона связанного белка будет постепенно (и очень медленно) продвигаться вниз по колонке. Это продвижение будет происходить с различной скоростью у различных белков в соответствии с их индивидуальными особенностями. В первую очередь с количеством и пространственным расположением ионогенных групп на поверхности белка. Так будет продолжаться вплоть до выхода двигавшихся зон из колонки в виде более или менее узких «пиков» колоколообразной формы. Выходить эти пики будут, очевидно, в том же порядке и с такими же интервалами (или перекрытиями!), с какими двигались по колонке зоны связывания соответствующих белков. Это и есть истинный процесс хроматографического фракционирования.

До сих пор мы игнорировали возможность нахождения на поверхности белка двух и более ионогенных групп подходящего знака. Однако из приведенных ранее цифр следует, что расстояния между двумя такими группами на поверхности белковой глобулы и между ионогенными группами на ионообменнике имеют один и тот же порядок величины. Это означает возможность реализации следующей цепи событий.

Молекула белка в результате электростатической связи одного из своих зарядов с неподвижным ионом матрицы закрепляется в одной точке и начинает, как уже было сказано, поворачиваться относительно этой точки. Может оказаться, что при одном из таких поворотов второй заряд на ее поверхности окажется вблизи заряда противоположного знака на той же или другой, близко проходящей нити обменника. Возникает вторая электростатическая связь молекулы белка с матрицей. Такое событие качественно меняет ситуацию. Закрепление белка на обменнике оказывается не вдвое, а на порядок величины более прочным. Это обусловлено независимостью двух связей, что позволяет им как бы «страховать» друг друга. Представим себе, что под тепловыми ударами молекул воды одна из связей разорвалась. Удерживаемая второй связью молекула белка не сможет далеко отойти от места первоначального контакта. Она будет поворачиваться около этой второй связи, и весьма вероятно, что в ходе таких поворотов первая связь восстановится. В другой момент две эти связи могут поменяться ролями.

Чтобы вклиниться в это явление «взаимной страховки», т. е. чтобы блокировать восстановление первой разорванной связи до того момецта, когда разорвется и вторая связь, потребуется значительное увеличение концентрации контрионов соли в элюенте. Если же молекуле белка удастся закрепиться в трех точках, то снять ее окажется очень трудно или даже невозможно (произойдет необратимая сорбция белка на ионообменнике).

В силу сказанного, для успешного фракционирования смеси белков следует до внесения препарата на колонку уравновесить жидкую фазу обменника раствором соли такой концентрации, которая гарантировала бы образование не более, чем двухточечных связей для всех белков смеси с матрицей.

Выбор условий хроматографии (например, для фракционирования смеси белков)

Этот выбор, даже для случая, когда все подлежащие разделению белки известны и, более того, имеются в чистом виде, оказывается делом непростым, требующим немалого опыта, понимания физических процессов, лежащих в основе фракционирования и даже определенной интуиции. Очень рискованно (с точки зрения потери ценного препарата) пытаться слепо повторять условия хроматографии, описанные в научной литературе даже для точно такого же или очень похожего случая. Реальные характеристики ионообменника той же марки (они варьируют от партии к партии) или используемых реактивов могут оказаться иными. Равно как и особенности исходных препаратов. Приняв к сведению описанную процедуру, исследователь должен сам продумать и спланировать свой хроматографический эксперимент. Сюда войдут, как минимум:

1. Выбор ионообменника (его силы, размера гранул, пористости).

2. Выбор геометрии колонки (длина и диаметр).

3. Выбор рН буфера с позиций как наиболее выгодных условий фракционирования, так и сохранения биологической активности всех белков смеси, например ферментов.

4. Выбор концентраций соли (контрионов) в элюенте.

5. Выбор типа элюции: изократической (с неизменной концентрацией соли), ступенчатой или градиентной (и какой формы градиента!)

6. Выбор скорости элюции.

Все эти условия надо подбирать одновременно, с учетом их взаимосвязи с целью оптимизации результатов фракционирования. Было бы слишком громоздко излагать здесь способы выбора каждого из названных параметров хроматографического процесса. Для иллюстрации остановлюсь на пунктах 4 и 5 — выборе концентрации соли и способах манипуляции этой концентрацией.

Выше было показано, что продвижение хроматографических зон связывания белков по колонке обусловлено, в частности, их десорбцией в местах первоначального и всех последующих закреплений на матрице в гранулах. За счет десорбции восстанавливается динамическое равновесие концентраций молекул в неподвижной и подвижной фазах слоя гранул, нарушенное вытеканием элюента, окружавшего этот слой. Десорбция первоначально сор-бированных молекул белка определяется концентрацией соля в жидкости внутри гранул. Если она слишком мала, то десорбции практически не происходит. Наоборот — открытые ионогенние группы матрицы как бы «высасывают» из элюента и закрепляют на себе молекулы белка. Если же концентрация соли в элюенте (а значит и внутри гранул) слишком велика, то практически все молекулы белка десорбируются с матрицы в жидкую среду, их концентрации в неподвижной и подвижной фазах уравниваются, как при гель-фильтрации.

Имея это в виду проведем мысленно следующий предварительный опыт. Выбранный ионообменник, уравновешенный уже выбранным буфером разольем равными порциями в 10 пробирок. Гранулы обменника, естественно, сядут на дно. Затем серией «декантаций« (т. е. сливом надосадочной жидкости, заменой ее на тот же буфер, но с определенной концентрацией соли, встряхиванием, осаждением — и так несколько раз) добиваемся того, чтобы концентрация соли внутри гранул постепенно увеличивалась от первой пробирки к десятой в определенных пределах (их придется подобрать для каждого белка). Затем во все пробирки внесем одинаковое количество концентрированного водного раствора одного из белков, входящих в состав подлежащей фракционированию смеси. Встряхиваем пробирки, даем отстояться осадку и по ультрафиолетовому поглощению (или ферментативной активности) оцениваем концентрацию белка в каждом из десяти супернатантов.

Находим первую пробирку, в супернатанте которой наш белок только-только появляется. Тем самым определяем концентрацию соли, при которой динамическому равновесию соответствует минимальная десорбция белка с матрицы. В последующих пробирках по мере увеличения концентрации соли, белка будет становиться все больше — десорбция при установлении динамл-ческого равновесия будет все значительнее. Наконец, придем к такой ситуации, когда концентрация белка в супернатанте окажется максимальной и при дальнейшем увеличении концентрации соли возрастать уже не будет. Концентрация соли в первой из этих пробирок укажет момент полной десорбции белка с матрзицы. В процентах от этой концентрации оценим и степень десорбции в промежуточных точках нашего анализа и построим зависимость процента десорбции данного белка от концентрации соли в условиях динамического равновесия. То же самое проделаем для всех остальных белков будущей смеси и получим серию кривых такого типа, как показана на рис.

Рис.

Рассматривая эту серию кривых, можно заключить, что при изократической элюции буфером с неизменной солевой концентрацией, например, соответствующей точке Ар можно надеяться разделить белки 1—4. Белок 1 будет сразу же полностью десорбиpoвать и выйдет в первую очередь — с током элюента. За ним последуют в порядке возрастания прочности сорбции белки 2, 3 и 4. Зона связывания каждого последующего из них будет двигаться по колонке медленнее, чем зона предыдущего белка. Белок 5 в этих условиях вовсе не выйдет из зоны первоначального нанесения препарата на колонку. Его можно снять отдельно, увеличив концентрацию соли в элюенте до значения Ag. Это уже будет «двухступенчатая» элюция.

Если окажется, что при концентрации Аg белки 3 и 4 разделяются плохо, можно воспользоваться трехступенчатой элюцией, выбирая концентрации соли в точках Вр Bg и Bg. Тогда сначала выйдут хорошо разделившиеся белки 1 и 2, затем также неплохо разделенные белки 3 и 4 и, наконец, белок 5.

Литература:

1 Курашвили Л.В., Бобылева Л.Н. Определение триглицеридов во фракции липопротеидов высокой плотности /Лабораторное дело. - N 7. - 1991. - С.7576.

2 Курашвили Л.В., Владимирова А.А. Содержание триглицеридов в ЛПВП у больных ишемической болезнью сердца //Кардиология. - 7-8. - 1992. - С.35-38.

3 Курашвили Л.В., Волков А.С. Прогностическая значимость определения холестерина в фракции липопротеидов высокой плотности у доноров крови // Гематология и трансфузиология. - N 5. - 1993. - С.39-41.