Функциональная активность лейкоцитов крови крыс, подвергшихся воздействию на них холода

Функциональная активность лейкоцитов крови крыс, подвергшихся воздействию на них холода

Функциональная активность лейкоцитов крови крыс, подвергшихся воздействию на них холода

А. Д. Тяпкина

При действии на организм экстремальных факторов, к числу которых относится переохлаждение, происходят изменения гомеостатических констант (прежде всего относящихся к системе крови). Белые клетки крови, имея высокую реактивность, быстро включаются в адаптационные реакции [3]. Они способны к неспецифическому реагированию в ответ на альтерирующие воздействия. Переохлаждение организма может быть вызвано внешними низкими температурами и фармакологическими агентами, способными снижать температуру тела. Это, главным образом, вещества, оказывающие наркотический эффект. К их числу относится этиловый алкоголь, способный воспроизводить все характерные черты влияния неингаляционных наркотиков на теплорегуляцию [5].

Изменение функциональной активности лейкоцитов при охлаждении организма, являясь сложной медико-биологической и клинической проблемой, изучено недостаточно. Целью нашего исследования была оценка некоторых функциональных свойств белых клеток крови при экзогенном охлаждении организма и гипотермии, вызванной низкой температурой окружающей среды в сочетании с действием этилового спирта.

Материал и методы исследования

Опыты проведены на 30 белых крысах - самцах, поделённых на 3 группы: контрольная (I), гипотермия (II), гипотермия + алкоголь (III). Животных II группы охлаждали в воде при температуре 15°С до появления признаков "холодового наркоза". Животным III группы за 20 мин. до охлаждения вводили через желудочный зонд 30%-ный раствор этилового спирта (1мл/100г).

Смешанную кровь для исследований брали путём декапитации у предварительно наркотизированных животных. Гепаринизированную кровь (10ед/мл) центрифугировали 10мин. при 1500 об/мин. Собирали лейкоциты, а примесь эритроцитов разрушали 0,83% раствором хлорида аммония. Клетки дважды отмывали изотоническим буферным раствором. Отмытые клетки ресуспендировали и определяли их концентрацию путём подсчёта в камере Горяева.

Фагоцитоз

Для исследования поглотительной способности нейтрофилов использовали частицы латекса размером 0,8мкм. Смесь лейкоцитов с латексом выдерживали во влажной камере при 37°С в течение 30 мин. при постепенном, легком взбалтывании. Затем готовили мазки, фиксировали 5 мин. в метаноле и окрашивали азур-II-эозином. Поглотительную способность нейтрофилов оценивали по числу фагоцитирующих клеток (фагоцитарная активность) и среднему числу поглощённых частиц (фагоцитарный индекс) [6].

Миграционная активность

Для постановки миграции под агарозой использовали модифицированный вариант, описанный в многочисленных работах [4,8]. Агарозу с добавлением культуральной клеточной среды 199 наслаивали на предметные стёкла. Для оценки спонтанной миграции в агаровом геле с помощью пробойника вырезали одну лунку, в которую помещали суспензию лейкоцитов. На втором стекле ставили реакцию индуцированной миграции. Для этого вырезали группу из двух лунок: одну - для клеточной суспензии, вторую - для хемоаттрактанта, в качестве которого использовали свежую плазму крови. Стёкла помещали во влажную камеру при 37°С на 2 ч., затем погружали в 2%-ный раствор глутарового альдегида на 60 мин. после фиксации и удаления агарозы, клетки окрашивали азур-эозином по Романовскому. В обоих случаях для оценки локомоционной активности измеряли площадь распространения клеток и рассчитывали хемотаксический дифференциал - отношение изменений площади индуцированной миграции по сравнению со спонтанной к площади клеточного ареала при самопроизвольной миграции (%).

Адгезионная способность

40 мкм суспензии лейкоцитов помещали в капилляр с внутренним диаметром 0,56 мм, предварительно обработанный аутоплазмой. Клетки инкубировали во влажной камере при 37°С в течение 60 мин. Затем капилляр перфузировали раствором Дульбекко при напряжении сдвига 0,1 Н/м2 и повторно - 30 Н/м2. Считали число клеток в исходной суспензии, а также первом (неадгезировавшие и с малой силой сцепления) и втором (со средней силой сцепления) смыве. Из полученных данных рассчитывали число клеток, оставшихся в капилляре (с большой силой сцепления) [9].

Механические свойства лейкоцитов

В основу эксперимента была положена методика Tran-Son-Tay R. с соавт. [11]. Вытягивали капилляры диаметром 4 мкм, помещали их в микрокамеру и соединяли с манометром. Вся система заполнялась изоосмотическим буфером. Перемещение клеток в капилляре и к капилляру обеспечивалось постоянным во всех опытах отрицательным давлением (60 мм вод. ст.). Все манипуляции проводили на предметном столике микроскопа. Для наблюдений и замеров использовали объектив 40 ВИ и окуляр-микрометр МОВ-1-15*. Регистрировали для каждой клетки первичные параметры (диаметр лейкоцита в исходном состоянии, длину и ширину деформированной клетки, время восстановления до сферической формы).

Осмотическая резистентность

Определение осмотической стойкости лейкоцитов проводили классическим способом по методу Сторти [10], подсчитывая процент клеток, сохранившихся после часовой экспозиции в 0,2% растворе хлорида натрия.

Результаты исследований и их обсуждение

В качестве фактора охлаждения была выбрана вода температуры 15°С, т.к. переохлаждение в водной среде по сравнению с воздушной (той же температуры) наступает в несколько раз быстрее [2].

Критерием сопротивляемости белых крыс к максимальному охлаждению служило время до появления признаков "холодового наркоза" после погружения животных в воду. Наступление "холодового наркоза" определялось замедлением, а затем и нарушением координации плавательных движений, появлением тонических судорог и погружением на дно аквариума. По ходу исследования было отмечено следующее.

Для крыс II группы была характерна двигательная активность в виде плавательных движений. Время до появления признаков "холодового наркоза" составляло в среднем 17 мин. Большая часть животных III группы была малоподвижна, но признаки "холодового наркоза" регистрировались в среднем через 23 мин. Изменения ректальной температуры у животных II группы составили в среднем 14°С, у животных III группы - 11°С. По данным литературы [2], такое снижение температуры характеризует среднюю степень гипотермии.

На основе полученных в эксперименте данных был сделан анализ изменений активных и пассивных свойств лейкоцитов в условиях переохлаждения организма, в том числе после введения этилового спирта. Анализ изменений поглотительной способности нейтрофилов в условиях гипотермии выявил незначительное снижение фагоцитарной активности (1%) с одновременным увеличением числа поглощенных частиц (19%). Охлаждение в условиях алкогольной интоксикации негативно сказывалось на функциональной активности нейтрофилов: снижались оба показателя (ФА-10%, ФИ -17%) (табл. 1).

Таблица 1

Показатели поглотительной способности нейтрофилов