Биологическая фиксация азота

Биологическая фиксация азота

БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Биологический факультет

Биологическая фиксация азота.

                                                                      Реферат

студента 3 курса 6 группы

                                                       Ковальчука К.В.

Минск 2003г.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение  ……………………………………………………………………………….3                                                                                                                           

Фиксация азота клубеньковыми бактериями.………………………………………...4

Биохимия азотфиксации………………………………….…………………………….5                                                                                                  

Применение азотфиксаторов на практике.………………….…………………………6                                                                                                    

Литература….……………………………………………………………………………7                                                                                                                     

Введение.

Азот является абсолютно необходимым элементом для всех живых организмов. Основным ре­зервуаром азота служит земная атмосфера.  Эукариотические организмы не способны усваивать азот непосредственно из атмосферы. Такой способностью обладает ограниченное количество ви­дов прокариот, которых называют азотфиксаторами, а процесс связывания азота атмосферы (вос­становление  до ) этими организмами - биологической азотфиксацией. Многие растения, животные и грибы способны вступать в симбиоз с азотфиксирующими прокариотами. Наиболее интенсивно азотфиксация протекает при образовании эндосимбиозов, когда микроорганизм про­никает внутрь тканей или даже в клетки хозяина. При этом микросимбионт обеспечивается пита­тельными веществами и энергией, необходимой для разрыва тройной связи N2, а хозяин получает легко усваиваемый. Биологическая азотфиксация представляет собой глобальный процесс, обеспечивающий существование жизни на Земле. Общая мировая биологическая фиксация азота составляет 17,2· т/год, что в четыре раза превышает связывание N2 в форме NH3 на предпри­ятиях химической промышленности. При этом продуктивность симбиотической азотфиксации со­ставляет 100-400 кг N/га.

Впервые прямые доказательства наличия азотфиксирующих микроорганизмов, живущих в сим­биозе с бобовыми растениями, были получены благодаря работам немецкого исследователя Гер­мана Гельригеля. Сравнивая источники азота для злаков и бобовых (1886 год), он показал, что если злаки черпают азот из минеральных веществ почвы, то бобовые, кроме того, обладают спо­собностью фиксировать азот воздуха. Такую способность бобовых Гельригель объяснял наличием на корневой системе клубеньков, развитие которых вызывают микроорганизмы. После работ Гельригеля стало ясно, что фиксация растениями азота связана с микроорганизмами, инфицирую­щими корневую систему растения. Потребовалось около десятка лет для подтверждения выводов Гельригеля о значимости симбиотических микроорганизмов рода Rhizobium для бобовых расте­ний как азотфиксаторов. Голландский бактериолог М. Бейеринк (M. Beijerinck) выделил в 1888 году клетки Rhizobium в чистой культуре. В дальнейшем была показана их способность инфици­ровать корневую систему бобовых с определенной степенью избирательности по отношению к конкретным видам растений и вызывать образование на корнях клубеньков - специализированных образований, в которых протекает азотфиксация.

Сейчас известно около 13 тыс. видов бобовых, многие из которых обладают способностью к симбиотической фиксации азота. Для каждого вида бобовых растений имеются свои разновидно­сти (штаммы) Rhizobium, которые и получили свои названия от названий хозяина (Rhizobium trifolii - клубеньковые бактерии клевера, Rhizobium lupini - клубеньковые бактерии люпина и т.д.).

 Выяснено также, что водный папоротник Azolla находится в симбиотических отношениях с азотфиксирующими цианобактериями. Некоторые деревья и кустарники (например, ольха, обле­пиха, восковик) имеют в качестве симбионтов актиномицеты. Поиск новых азотфиксирующих пар растение - микроорганизм далеко не закончен.

В 70-80-х годах нашего столетия в лаборатории доктора Джоан Доберейнер (J. Dobereiner)  в Бра­зилии активизировались поиски азотфиксирующих микроорганизмов, обитающих на поверхности корневой системы диких и культурных злаков. Такие микроорганизмы, живущие в ассоциации с растением, называются ассоциативными азотфиксаторами. Число их видов велико, но благодаря работам доктора Дж. Доберейнер и ее последователей в центре событий оказались микроорга­низмы рода Azospirillum. Азоспириллы легко инфицируют корневую систему злаков и других рас­тений. Подобно Rhizobium, они делятся на виды, колонизирующие преимущественно те или иные сорта злаков, фиксируют азот воздуха, могут продуцировать гормоны роста растений и обладают еще другими свойствами, положительно влияющими на рост и развитие растений.

Кроме того, известны азотфиксирующие микроорганизмы, свободноживущие в почве, на рас­тениях, в воде. Впервые выделить культуру свободноживущих азотфиксирующих микроорганиз­мов удалось в 1893 году С.Н. Виноградскому. Он выделил почвенный спороносный анаэробный микроорганизм, относящийся к роду Clostridium , названный автором в честь выдающегося фран­цузского микробиолога Л. Пастера Clostridium pasteurianum. В 1901 году М. Бейеринк выделил аэробно живущий почвенный микроорганизм Azotobacter, способный к азотфиксации, неприхот­ливый при выращивании. Этот микроорганизм интенсивно исследуют не только как удобную мо­дельную культуру, но и применяют в технологии обогащения сельскохозяйственных посевов био­логическим азотом. С тех пор коллекции свободноживущих азотфиксаторов постоянно увеличи­ваются, особенно с 1949 года, когда в арсенал методов регистрации фиксации азота вошли метод изотопных индикаторов () и реакция восстановления ацетилена в этилен, катализируемая основ­ным ферментом системы азотфиксации - нитрогеназой. Тогда выяснилось, что способностью к фиксации азота обладают большинство аноксигенных фототрофных бактерий, многие цианобак­терии, некоторые бациллы, клебсиеллы и др.

Фиксация азота клубеньковыми бактериями.

Наибольший вклад в биологическую азотфиксацию вносят клубеньковыми бактериями (ризо­бии). Ризобии представляют собой грамотрицательные бактерии, образующие клубеньки с расте­ниями семейства бобовых. Клубеньковые бактерии теперь делят на пять родов: Azorhizobium, Rhizobium Mesorhizobium, Sinorhizobium (быстрорастущие) и Bradyrhizobium (медленнорастущие).

В основе способности инфицировать корневую систему хозяина лежит сложнейший и не вполне ясный молекулярный механизм, имеющий решающее значение в симбиотической фиксации азота. На первом этапе происходит приближение микробной клетки к растению за счет ее способности передвигаться в ответ на узнавание химических продуктов, выделяемых из корней растения (хе­мотаксис). Происходит  контактное взаимодействие микроорганизма с растением. В этом процессе важное место отводится так называемому лектин-углеводному узнаванию растения микроорга­низмом. Лектин корневых волосков растений (углеводузнающий белок) узнает углевод поверхно­сти бактерий и прочно связывается с ним. Происходит взаимное узнавание партнеров и подго­товка к формированию симбиотической системы. Растение в нано- или пикомолярных концентра­циях начинает продуцировать специфичные флавиноиды, которые активируют гены вирулентно­сти (Nod-гены) ризобий. Nod-гены кодируют синтез Nod-факторов (липоолигосахаридов), вызы­вающих у растения-хозяина скручивание корневых волосков и образование клубеньковой мери­стемы.  В месте резкого сгиба волоска пектолитические ферменты растения разрушают клеточную стенку, через которую бактерии и проникают внутрь. Вокруг этих бактерий образуется полость – инфекционная нить, стенки ее образованы растительными клетками, а внутреннее пространство заполнено полисахаридами растения и микросимбионта.

Далее происходит эндоцитоз ризобий из инфекционной нити внутрь клеток растения-хозяина. В цитоплазме растительной клетки бактерии окружаются специальными перибактероидными мем­бранами (ПБМ), синтезируемыми в основном растительной клеткой и частично ризобиями. Коли­чество ризобиальных клеток внутри ПБМ зависит от вида растений и обычно составляет от 1 до 10 клеток. Бактериальные клетки, окруженные общей ПБМ, называются симбиосомой и являются основной структурно-функциональной единицей симбиоза.

Вскоре ризобии в ПБМ преобразуются в особые симбиотические формы – бактероиды, имею­щие в три-пять раз большие размеры, чем свободноживущие бактерии. Все это способствует фор­мированию на поверхности корней клубеньков. Азотфиксирующий клубенек состоит из следую­щих частей: а) инфицированная бактериями ткань, б) проводящая ткань, поставляющая углеводы и выносящая продукты азотфиксации, в) меристема, за счет которой идет рост клубенька. Морфо­логия и число клубенька строго определяется растением-хозяином, что возможно связано с боль­шой энергоемкостью их образования.

Клубеньковые бактерии более экономно используют энергию, необходимую для фиксации азота, затрагивая 3-4 г углеводов на 1 г азота, в то время как свободноживущие азотфиксирующие бактерии затрачивают 50 - 100 и более граммов на фиксацию 1 г азота. Это связано с тем, что у
свободноживущих азотфиксаторов фиксация азота происходит в процессе их роста, и потому большое количество энергии потребляется на этот рост. Кроме того, в целях создания благоприятных условий для активности нитрогеназы - фермента, участвующего в фиксации азота, для снижения парциального давления кислорода усиливается дыхание, что связано с затратой энергии. Эти расходы энергии отсутствуют у клубеньковых бактерий, поскольку фиксация азота происходит в бактероидах, клетках, прекративших рост, а внутри клубеньков создаются благоприятные условия
для активности нитрогеназы, в том числе сниженное содержание кислорода. Очень существенно то, что фиксируемый клубеньковыми бактериями азот на  90 - 95% передается бобовым растениям. Бобовые, получая связанный азот от клубеньковых бактерий, не зависят или мало зависят от обеспечения минеральным азотом почвы и потому могут успешно произрастать совместно
с другими растениями на почвах, бедных доступными формами азота.Количество азота, фиксируемого клубеньковыми бактериями бобовых, сильно варьирует от фитоценоза к фитоценозу, а в пределах конкретных фитоценозов может изменяться от года к году. Оно определяется участием
бобовых в фитоценозах, условиями среды и эффективностью соответствующих рас бактерий. Для некоторых лугов в Новой Зеландии с травостоями, где преобладает клевер, отмечена фиксация азотом до 450 - 550 кг/га.

Общий уровень азотфиксирующей активности свободно живущих организмов невысок. В зависимости от вида и условий существования они накапливают в год от 10 до 30 - 40 кг связанного азота на гектар.

Биохимия азотфиксации.

Микроорганизмы, усваивающие молекулярный азот, называются диазотрофами. Основным эле­ментом симбиоза является нитрогеназа – многомерный фермент, состоящий из комплекса двух белков: MoFe-белка и Fe-белка. Нитрогеназы из разных азотфиксаторов несколько различаются своими молекулярными массами и содержанием металлов. Каждый из белков, в свою очередь, со­стоит из нескольких субъединиц. Молекулярная масса MoFe-белка различных нитрогеназ нахо­дится в пределах 200-250 кДа. Фермент содержит по два атома молибдена, 28-34 атома железа и 18-24 атома серы на одну молекулу. Молекулярная масса Fe-белка колеблется от 50 до 70 кДа и также содержит атомы железа и серы. Нитрогеназа синтезируется в бактероидах и является ката­лизатором фиксации азота:

N2 + 8[H] + 2à 2  + H2

Этот процесс требует затраты энергии. По расчетам для клеток Rhizobium восстановление одной молекулы N2 требует затраты 25-35 молекул АТФ, то есть на каждый грамм фиксированного азота расходуется три-шесть грамм органического углерода. Кроме АТР нужны также восстановленные пиридиннуклеотиды и ферредоксины в качестве восстановительной силы.

Нитрогеназа обладает низкой субстратной специфичностью, т.е. обладает способностью восста­навливать широкий спектр соединений, например, превращать ацетилен в этилен. Данная реакция применяется для определения нитрогеназной активности ацетиленовым методом. Ацетилен вос­станавливается только до этилена, который легко поддаётся количественному определению с по­мощью газовой хроматографии.

Для активной работы нитрогеназы необходимы микроаэрофильные условия. Молекулярный кислород оказывает повреждающее действие на оба белка нитрогеназы, но более чувствителен к O2 Fe-белок. Чувствительность белков нитрогеназы к O2 определяется прежде всего чувствительностью их металлоцентров, которые участвуют как в связывании субстрата, так и в переносе электронов. Поскольку при этом может происходить и ступенчатое восстановление O2 по одноэлектронному механизму, в качестве продуктов такого восстановления возникают супероксидные ионы, перекись водорода и синглетный кислород, вносящие свой вклад в окислительное повреждение нитрогеназы. Нитрогеназные белки являются не единственным компонентом азотфиксирующей системы, чувствительным к O2. Ферредоксины и флаводоксины, донирующие электроны на нитрогеназу, могут автоокисляться и подвергаться необратимым окислительным повреждениям.

Микроаэрофильные условия в клу­беньке обеспечиваются диффузным барьером (слой плотно прилегающих друг к другу клеток во внутреннем кортексе) и синтезом леггемоглобина (гемоглобинподобный белок, синтезируемый растительными клетками). Леггемоглобин связывает O2, транспортирует его к симбиосомам, обеспечивая дыхательную активность клубеньков. Он составляет 30 % белка в клубеньках и при­дает им ярко-розовый цвет. Нитрогеназный комплекс, образующий аммиак из воздуха, действует по очень экономно. Если в среде обитания достаточно ионов аммо­ния или нитратов, он прекращает работу.

Потребление растениями аммиака, образовавшегося при азотфиксации или восстановлении нитратов почвы, осуществляется ферментами, связанными с биосинтезом так называемых первич­ных аминокислот, прежде всего глутаминовой, аспарагиновой кислот и их амидов. Одним из ак­тивно изучаемых ферментов является, например, глютаминсинтетаза. Этот фермент катализирует реакцию

глутаминовая кислота + NH3 + АТР à глутамин + ADP + Pi

Этот фермент встречается во всех организмах и принимает участие в присоединении аммиака к глутаминовой кислоте с образованием ее амида и последующим использованием его в различных реакциях синтеза азотсодержащих органических соединений. Близким по механизму действия яв­ляется и аспарагинсинтетаза:

аспарагиновая кислота + + NH3 + АТР à аспарагин + ADP + Pi

Синтез аминокислот и амидов происходит с участием и других ферментов: глутаматдегидроге­назы, аспартазы и т.д. В конечном итоге азот в виде аминогрупп вовлекается в серию биосинтети­ческих реакций организма, поддерживая его жизненные функции.

Применение азотфиксаторов на практике.

Открытие азотфиксаторов привело к созданию так называемых микробных удобрений. Уже в 1895 году Наббе и Хилтнером запатентован препарат микробной культуры Nitragin. Он выпус­кался в 17 вариантах для различных растений. Препарат представлял собой культуры азотфикси­рующих микроорганизмов, смешанных с почвой, торфом, песком, навозом и другими субстра­тами. Внесение нитрагина в почву или обработка семян назывались инокуляцией и позволяли фермеру повысить качество и количество продукции. В первой половине XX века наблюдался не­уклонный рост научно-исследовательских работ по созданию перспективных микробных препара­тов для бобовых и небобовых культур.

После второй мировой войны начался период химизации сельскохозяйственного производства и работы по исследованию микробиологических препаратов стали свертываться. Возможности большой химии, дешевизна азотных удобрений, простота их использования как бы отодвигали на второй план микробные препараты. Однако выяснилось, что интенсивное использование синтети­ческих азотных удобрений кроме положительного эффекта (роста урожайности) несут в себе большую опасность. Происходит загрязнение азотсодержащими веществами почвы, подпочвен­ных вод, рек и озер. Минеральные удобрения вымываются из почвы, выщелачиваются и стано­вятся вредными для человека соединениями - нитритами, нитрозаминами и т.д. поэтому в послед­нее время отдаётся предпочтение микробным препаратам.

Сейчас спектр применяемых микропрепаратов под бобовые, злаковые и другие культуры до­вольно широк. Штаммы ризобий, используемые для инокуляции сельскохозяйственных бобовых культур, обычно выделяются из клубеньков этих же видов, однако в качестве источника таких штаммов могут быть использованы и некоторые дикорастущие виды бобовых.

 В конце XX века во многих странах нитрагенизации подвергается 70-80 % бобовых культур. В районах традиционного возделывания бобовых культур прибавка урожая от применения нитра­гина оставляет 2-4 ц/га зерна сои, 1-2 ц/га зерна гороха и люпина, 80-100 ц/га зеленой массы бобо­вых культур, 6-12 ц/га сена клевера и люцерны. На почвах, где бобовые культуры ранее не возде­лывались и в которых нет специфичных для них клубеньковых бактерий, дополнительный сбор сельскохозяйственной продукции за счет применения препаратов клубеньковых бактерий дости­гает 50-100 % и более.

Литература.

1. Шлегель Г. Общая микробиология. М.: Мир, 1987, 576 с.

1. Гусев М.В., Минеева Л.А. Микробиология. М.: Изд-во МГУ, 1992, 448 с. 

1. Игнатов В.В. Биологическая фиксация азота и азотфиксаторы // Соросовский образо­вательный журнал. 1998.